該文描述了一個基于熒光檢測的高通量解螺旋酶活性篩選系統(tǒng),并利用該系統(tǒng)測試了HCV病毒NS3解螺旋酶對DNA及RNA底物的解螺旋活性監(jiān)控本系統(tǒng)采用一個人工合成的寡聚雙鏈DNA分子信標(biāo)為底物該底物雙鏈分子中的短鏈(信標(biāo)鏈)的一端連接一個熒光基團(tuán),在另一端則連接一個熒光猝滅分子;信標(biāo)鏈進(jìn)一步同一個更長的DNA或RNA寡居核苷酸結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈底物該底物分子在解螺旋酶和ATP的作用下雙鏈打開后,信標(biāo)鏈形成分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu),熒光基團(tuán)同猝滅基團(tuán)靠近而引發(fā)熒光猝滅因而檢測熒光猝滅即可監(jiān)控解螺旋酶的活性變化不同于傳統(tǒng)的是螺旋酶活性檢測方法,本方法是不可逆的;因此在測定過程中也無須加入額外的DNA單鏈以防止解鏈后的底物再次結(jié)合該文作者構(gòu)建了若干種基于不同熒光分子的反應(yīng)體系,包括Z常用的Cy3和Cy5染料分子文中也介紹了基于該技術(shù)的高通量篩選應(yīng)用Tecan的Infinite M200多功能酶標(biāo)儀被用于反應(yīng)體系的熒光檢測;其結(jié)果表明,在384孔微孔板格式下,Infinite M200提供的高靈敏度能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的高通量篩選,篩選體系的Z(評價篩選體系的穩(wěn)定性及可靠性的數(shù)字指標(biāo))可達(dá)到0.7以上 Infinite? 200 Pro多功能微孔板檢測儀
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