概述
本文的研究目的是確定在復(fù)雜生物測定中，使用水鏡成像提高圖像質(zhì)量的同時是否可以應(yīng)用于高通量場景。
介紹
本文涉及的所有測試均在 96/384 孔板或市售的單器官芯片板中進(jìn)行。研究中使用空氣鏡或水鏡的實驗流程包括樣品的激光自動聚焦等環(huán)節(jié)保持相同。研究發(fā)現(xiàn)，通常在相同信噪比的條件下，使用水鏡可以明顯縮短曝光時間；因而，基于成像過程中熒光通道數(shù)量、熒光強度以及樣品是2D 成像還是 3D 成像等不同條件，整板成像的時間Z高可比標(biāo)準(zhǔn)空氣物鏡的快30％。此外，在需要注水之前，使用水鏡可以對多達(dá)數(shù)百個樣品板成像。
水鏡與空氣鏡的比較實驗如下：
? 使用魚藤酮和氯喹處理得到劑量反應(yīng)曲線，并進(jìn)行線粒體融合和膜完整性評價。
? 化合物處理 HCT116 ( 結(jié)腸癌細(xì)胞 ) 后，對細(xì)胞球生長情況進(jìn)行評價并計算細(xì)胞死活率。
? 用血管生成抑制劑處理后，于單器官芯片上培養(yǎng)復(fù)雜的 3D 血管生成樣品，并采集圖像數(shù)據(jù)。
此外，我們用低倍鏡對整個微孔板成像，識別感興趣的稀有個體后，可以再使用高倍的水鏡自動重新成像。

材料和方法

高內(nèi)涵系統(tǒng) Image Xpress-confocal水鏡系統(tǒng)硬件

實驗?zāi)Ｐ?/span>
? 實驗耗材：
Corning? spheroid microplates(384 well format)
Mimetas OrganoPlate? 3-Lane
InSphero Akura? 384 well plate
Greiner SensoPlate? - 96 and 384
? 細(xì)胞：
3D InSight? 腫瘤微組織 (InSphero)
HUVEC ( 人類原代內(nèi)皮細(xì)胞 )
HCT-116 ( 人類結(jié)腸直腸癌細(xì)胞 )
Caco-2 ( 人類結(jié)腸直腸癌細(xì)胞 )
PC-12 ( 大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 )

圖 1 比較 20X 0.75NA 空氣鏡和 20X 0.95NA 水鏡的細(xì)胞球重構(gòu)側(cè)視圖表明，由于降低了球面畸變，圖像質(zhì)量得到了明顯改善。 水的折射率與樣品所懸浮介質(zhì)的折射率更接近，因此位于平板底面上方 > 300 um 腫瘤球體的圖像可以更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞和整個球體的形態(tài)特征，而不會出現(xiàn) Z 軸的拉伸現(xiàn)象。 此外，使用水鏡 ( FITC 波長 ) 產(chǎn)生相同的信號強度只需要相對空氣鏡1/3的曝光時間。
結(jié)果
線粒體完整性和融合測定
線粒體的形成和完整性的表征對于理解疾病的機(jī)制和毒性評估很重要。線粒體的長度、亮度和數(shù)量會在線粒體循環(huán)、代謝變化或凋亡過程中發(fā)生變化。成像后光強度和線粒體形狀可以通過使用 Meta Xpress軟件中的工具來確定，該工具可以通過用戶自定義標(biāo)準(zhǔn)來測量“顆粒度”，“纖維數(shù)”或“自定義區(qū)域數(shù)”等指標(biāo)，這些指標(biāo)可以用于計算各種化合物的劑量效應(yīng)和有效濃度。

器官芯片
水鏡提高了物鏡附近 2D 表面不平整的樣本分辨率和球形度。這在做 3D 模型成像 ( 尤其是器官芯片樣本 ) 時具有優(yōu)勢。我們使用水鏡以 OrganoPlate 3-Lane 模式對芯片上腸道和血管生成模型進(jìn)行成像。
3 D 篩選 ( quick ID、靶點成像 )通常，有多種用以篩選抗腫瘤藥物的培養(yǎng)細(xì)胞球的方法。在某些拍攝過程中，橢球體并非始終位于孔的中心，這可能使得鏡頭很難以高放大倍數(shù)在單個視場 (FOV) 中獲取感興趣的對象。QuickID 允許我們使用 20X 的水鏡對 FOV 中心的每個球狀體進(jìn)行自動成像，以收集多個通道的 Z 軸層掃圖像，而無需獲取額外的位置信息。

對細(xì)胞球活力的定量測量3D 腫瘤模型越來越多地用于癌癥研究。在此示例中，我們使用從 HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)形成的 3D 球體，通過計算細(xì)胞死活率來評價藥物對細(xì)胞球體的毒性作用。

圖 2 用氯喹 ( 線粒體循環(huán)抑制劑 ) 和魚藤酮 ( 氧化磷酸化抑制劑 ) 在指定濃度下處理 PC12 細(xì)胞24 小時。 用 MitoTracker Orange CMTMRos ( 黃色 ) 和Hoechst (未顯示) 染細(xì)胞，用 40X 水鏡和非水鏡分別拍攝圖像 (A)，使用 MetaXpress 軟件處理數(shù)據(jù)，分析確定“顆粒度”(左) 或“纖維數(shù)”(右) (B)，自定義區(qū)域模擬圖層顯示了完整的顆粒、纖維或區(qū)域定量 (C) ，計算 EC50 ( 四個復(fù)孔 ) ，水鏡可以提高圖像質(zhì)量，更準(zhǔn)確地計算顆粒數(shù)，從而獲得更高的 Z 值 (D) 。

圖 3 以 Mimetas 提供的方案培養(yǎng)Caco2 細(xì)胞，形成完整的腸管模型。用 Hoechst 和 AlexaFluor-488 耦合的鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞進(jìn)行染色，并在整個管路中拍攝Z軸層掃共聚焦圖像。(A) 使用 40 倍水鏡成像的細(xì)胞底層 ( 左 ) 和頂層 ( 右 ) 。(B) 拍攝鬼筆環(huán)肽-AlexaFluor 555、Hoechst和抗 VE 鈣黏著蛋白染色的 HUVEC細(xì)胞的血管生成模型，用 20X 水鏡采集 50 個 Z 軸的 2D 投影顯示未處理的細(xì)胞 ( 右 ) 和抗血管生成化合物處理的細(xì)胞 (左) 。
結(jié)論
? 水鏡非常適合標(biāo)準(zhǔn)微孔板或單器官芯片形式的自動化成像分析。
? 如果在采集過程中使用了水鏡，則距板底 100 um 的物體的球面像差會降低。
? 在 384 孔板中進(jìn)行 2 色分析時，使用水鏡的圖像采集時間Z多可減少 30％。
? 在復(fù)雜的生物學(xué)檢測中，使用水浸鏡頭成像使圖像質(zhì)量以及數(shù)據(jù)質(zhì)量得到了改善。

圖 5 用 HCT116 細(xì)胞 ( 4000 個 ) 在 U 型底 384 孔板中的培養(yǎng)形成細(xì)胞球體。 antcancer化合物處理細(xì)胞球 48 小時，然后用 Hoechst 和 EthD-1 染色 3 小時 (A)。使用具有 20X 物鏡的共焦選件對孔板進(jìn)行成像 ( 水鏡或者非水鏡 (B) ) ，將 11 張間隔 10 um 的圖像進(jìn)行 Z 軸堆疊，然后使用核計數(shù)或自定義模塊編輯器分析Z大投影圖像。統(tǒng)計細(xì)胞核或活細(xì)胞的數(shù)量來定量 EC50 進(jìn)而研究化合物的性質(zhì)。由于對整個球體中細(xì)胞的計數(shù)更加精確，使用水鏡會得到更大的 Z 值。