地 西泮，又名安定，屬于苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥物。在我國地 西泮被列為第二類精神藥品管控，具有鎮(zhèn)定、催眠、抗癲癇、戒酒、麻醉等作用，在人類和獸藥臨床使用廣泛。近年來地 西泮在水產(chǎn)品中頻繁檢出，水產(chǎn)品中污染源頭和使用意圖尚不明確，可能由餌料、運輸、養(yǎng)殖環(huán)境污染引入。地 西泮會影響水生生物行為學(xué)特征，有一定的生物蓄積作用，可通過食物鏈進入人體，威脅人體健康，長期暴露會導(dǎo)致嗜睡疲乏、精神混亂，甚至?xí)a(chǎn)生依賴性和耐藥性。

我國《GB 31650－2019 食品安全國家標準 食品中獸藥Z 大殘留限量》中規(guī)定地 西泮允許作治 療用，但不得在動物性食品中檢出。農(nóng)業(yè)部176號公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中明確禁止在飼料和飲用水中添加地 西泮。《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1、2號》規(guī)定在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中不得使用地 西泮。

目前水產(chǎn)品中地 西泮殘留量檢測的標準方法是《 SN/T 3235-2012 出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，采用基質(zhì)外標法定量測定，安譜實驗參照 SN/T 3235-2012 的前處理方法，并進行優(yōu)化，建立了一種快速、簡單、準確的測試方法-溶劑內(nèi)標法。

標準溶液配制

01

標準品

地 西泮標準貯備溶液：1 000 mg/L于甲醇。貨號：CDAA-S-770050-AD-1.2mL。

地 西泮-D5同位素內(nèi)標貯備溶液：1 00 mg/L于甲醇。貨號：CDAA-S-770054-AA-1.2mL。

02

中間溶液配制

地 西泮標準中間溶液1：1 mg/L于甲醇。

地 西泮標準中間溶液2：0.1 mg/L于甲醇。

地 西泮-D5同位素內(nèi)標中間溶液1：1 mg/L于甲醇。

地 西泮-D5同位素內(nèi)標中間溶液2：0.1 mg/L于甲醇。

03

系列標準工作溶液配制

分別精密量取地 西泮標準中間溶液和地 西泮-D5同位素內(nèi)標中間溶液適量，用10%乙腈水溶液稀釋制成地 西泮-D5濃度為2 ng/mL，地 西泮濃度為0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的系列標準工作液，供LC-MS/MS測定。以地 西泮特征離子對峰面積與同位素內(nèi)標物特征離子對峰面積比值為縱坐標、相應(yīng)的濃度比為橫坐標繪制標準曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

試劑配制

乙酸銨緩沖溶液：稱取7.7 g乙酸銨于480 mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值到5.2，以水定容至500 mL。   

1%氨水-乙腈溶液：準確吸取40 mL 25%的氨水至1000 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，混勻。

1%乙酸-乙腈溶液：準確吸取10 mL冰乙酸至1000 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，混勻。

無水硫酸鈉：分析純，500℃灼燒4 h，置于干燥器中備用。

前處理操作

01

樣品（魚）前處理

提取：稱取試樣2g（精確到0.01g）置于50mL具塞離心管中，準確加入40μL地 西泮-D5內(nèi)標中間溶液2（0.1 mg/L）（加標樣品加入一定量的標準中間溶液），加入8 mL乙酸銨緩沖液，高速渦旋混勻30s，室溫靜置30min。加入15 mL 1%氨水-乙腈溶液，5.0 g無水硫酸鈉，渦旋混勻1min，4℃ 9500 r/min離心5min。收集上清液于另一個干凈的50 mL具塞離心管中。剩余混合物中加入15 mL 1%乙酸-乙腈溶液，渦旋混勻10 min，4℃ 9500 r/min離心5min，吸取上清液，合并兩次提取有機相至同一離心管，待凈化。 

凈化：向待凈化液中加入QuEChERS吸附劑（貨號SBEQ-CA8454-25，含600 mg MgSO4，100 mg PSA，40 mg C18），高速渦旋1 min，4℃ 9500 r/min離心5min，吸取所有有機相溶液至100 mL雞心瓶中，42℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。加入2.0 mL 10%乙腈-水溶液，渦旋混合1min，過0.22μm水系濾膜，濾液供LC-MS/MS測定。

02

樣品加標

①加標水平 0.5 μg/kg（對應(yīng)上機溶液濃度 0.5 ng/mL）：稱取樣品后，加入10μL 標準中間溶液2（0.1 mg/L），n=6；

②加標水平 1.0 μg/kg（對應(yīng)上機溶液濃度 1.0 ng/mL）：稱取樣品后，加入20μL 標準中間溶液2（0.1 mg/L），n=6；

③加標水平 2.0 μg/kg（對應(yīng)上機溶液濃度2.0 ng/mL）：稱取樣品后，加入40μL 標準中間溶液2（0.1 mg/L），n=6。

儀器條件

01

液相色譜條件

色譜柱：Athena C18-WP 液相色譜柱（2.1mm*100mm，5μm，貨號：LAEQ-211572）；

流動相：A：0.1%甲酸水，B：0.1%甲酸甲醇

表1 液相色譜梯度洗脫條件

流速：0.25mL/min

柱溫：35℃

進樣量：10 μL

02

質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源

掃描方式：正離子掃描

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）

碰撞氣(CAD)：8 psi;

門簾氣(CUR)：35 psi;

噴霧氣(GS1)：60 psi;

輔助氣(GS2)：65 psi;

離子噴霧電壓（IS）：5500V;

加熱溫度(TEM)：550℃；

地西 泮及地 西泮-D5的主要參考質(zhì)譜參數(shù)見表2

表2 地 西泮及地 西泮-D5的主要參考質(zhì)譜參數(shù)

實驗譜圖

圖1 標準溶液譜圖（1 ng/mL地 西泮+2 ng/mL地 西泮-D5）

圖2 魚肉基質(zhì)空白譜圖

圖3 魚肉基質(zhì)加標譜圖（加標水平1 μg/kg）

同位素內(nèi)標法標準曲線

線性方程：y=1.05x-0.0104（r=0.9999）

同位素內(nèi)標法定量結(jié)果

表3  魚肉基質(zhì)加標回收率數(shù)據(jù)

SN/T 3235-2012基質(zhì)外標法測試

魚肉中地 西泮結(jié)果

實驗結(jié)論

隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)在市面上已經(jīng)可以采購到地 西泮的同位素內(nèi)標，采用溶劑同位素內(nèi)標法魚肉基質(zhì)0.5、1、2 μg/kg加標回收率在80 ~100%，與采用基質(zhì)外標法定量加標回收率75~110%可以達到異曲同工的效果，且可以節(jié)約大量的前處理時間。

實驗耗材