簡介
藥物誘導(dǎo)的人類 hERG 離子通道阻滯與患者潛在的致死性室性快速心律失常的易感性有關(guān)。近年來，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)的一些藥物由于對 hERG 的脫靶作用而退出市場。因此，在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期階段，迫切需要鑒定能夠阻斷 hERG 通道的化合物。在此，我們展示在 FlexStation 3 多功能酶標(biāo)儀上，一種新的鉀離子通道檢測試劑盒研究 hERG 化合物活性的用途。這種分析方法利用了tuo離子 (Tl+) 的滲透性，通過鉀離子通道進(jìn)入胞質(zhì)，然后被一種新型熒光指示劑檢測到。7 種參照的 hERG阻滯劑在中等 通 量細(xì)胞試 驗(yàn)中進(jìn) 行檢 測，并將 FLIPR TetraSystem 和 IonWorks Barracuda Plus Automated Patch Clamp System 收集的數(shù)據(jù)值進(jìn)行比較。

優(yōu)點(diǎn)
? 細(xì)胞水平的鉀離子通道活性的功能測定
? 均相免洗特性可降低孔間差異并簡化操作流程
? 相比于非均質(zhì)化實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)展了信號窗口

材料和方法
FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒 ( 圖 1 ) 含有對tuo敏感的指示劑。在起始的染料加樣步驟，tuo離子指示劑以乙氧基甲基酯
(AM) 的形式通過被動擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞質(zhì)的酯酶可切割 AM 酯并釋放其活性熒光構(gòu)型。此外，一種具有專利的掩蔽染料應(yīng)用于細(xì)胞外以降低背景熒光。細(xì)胞被鉀離子和tuo離子的混合物或tuo離子存在下的配體刺激，可以激活鉀離子通道。熒光信號的增加表示tuo離子流入細(xì)胞內(nèi)，確切地說是通過鉀通道流入，因此顯示了鉀離子通道功能性的活性測量。FLIPR Potassium Assay Explorer Kit (MolecularDevices Cat# R8222) 試劑盒包含tuo離子敏感的染料，掩蔽染料用于均質(zhì)化操作，200 mM 硫酸鉀，50mM 硫酸t(yī)uo，5x 無氯緩沖液，HBSS + 20 mM HEPES 緩沖液。此試劑盒支持 10 塊96 孔或 384 孔板。實(shí)驗(yàn)流程如圖 2。
制備化合物
化合物的疏水性質(zhì)影響表觀效力值，可能是由于與實(shí)驗(yàn)器具的非特異性結(jié)合。在這項(xiàng)研究中，化合物首先在 100% DMSO中稀釋，然后在檢測前立即與 HBSS + 20 mM HEPES 緩沖液一同轉(zhuǎn)移至玻璃內(nèi)襯的聚丙烯板中。
實(shí)驗(yàn)流程
人 hERG 離子通道基因 Kv11.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞， 由ChanTest Corporation (Cleveland, OH) 公司提供。在實(shí)驗(yàn)

前兩天，以 25000 個細(xì)胞 / 孔的密度將細(xì)胞種在黑色透明底的 96 孔板中，加入含有選擇抗生素的生長培養(yǎng)基并在37℃
和 5% CO2 環(huán)境下孵育。在實(shí)驗(yàn)前的 24 小時，將生長培養(yǎng)基換成含有四環(huán)素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)前的 4 小時，將細(xì)胞孵育溫度從 37° C 切換到 28℃，以增強(qiáng)細(xì)胞膜上 hERG 離子通道的表達(dá)。微孔板細(xì)胞與染料一起在室溫下避光孵育 1小時。
藥理學(xué)分析時，首先加入 hERG 通道阻滯化合物，室溫孵育30 分鐘。在 FlexStation 3 酶標(biāo) 儀檢 測時，添加先前優(yōu)化過的刺激緩沖液至每個孔中。在 SoftMax Pro 軟件中設(shè)置激發(fā)波長 485nm, 發(fā)射波長 538nm。每列的信號采集大約 120秒， 間 隔 1.52 秒。 為了 進(jìn) 行 對 比，使 用 FluxOR Assay Kit(Life Technologies) 試劑盒，按其實(shí)驗(yàn)手冊進(jìn)行平行試驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析在 SoftMax Pro 軟件和 GraphPad Prism 軟件中完成。
通過確定刺激 hERG 通道所需的tuo和鉀的Z佳濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法的開發(fā)。在微孔板中測試不同濃度組合的硫酸鉀和硫
酸t(yī)uo的刺激緩沖液，tuo離子和鉀離子緩沖液使 用 1x 無氯緩沖液稀釋。硫酸t(yī)uo和硫酸鉀每摩爾有兩倍量的陽離子，因此
我們認(rèn)為它們的陽離子濃度是各自濃度的 2 倍。檢測時，將刺激緩沖液加入孔中的細(xì)胞，比 較不同濃度組合的信號軌
跡，以確定提供Z大信號的Z佳濃度組合。使用 FLIPR TetraSystem 得到的數(shù)據(jù)顯示，能夠刺激 hERG 并提供Z大信號的Z優(yōu)或Z終的tuo離子濃度是 1 mM，鉀離子濃度時 10 mM。

圖 2 在 FlexStation 3 酶標(biāo)儀上，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的工作流程。

電生理
為了進(jìn)行比較，從 IonWorks Barracuda 全自動膜片鉗系統(tǒng)獲得了同一組 hERG 通道阻斷劑的 IC50 值 ( 圖 3 )。為了捕獲化合物使用依賴性的效應(yīng)，在化合物添加前后，施加 5 次 0.1Hz 的電壓。hERG 尾電流在第五次掃描時的峰值振幅被用來測量該化合物的效應(yīng)。
結(jié)果
在 FlexStation 3 酶標(biāo)儀上使用 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒鑒定七個已知的 hERG 通道阻滯劑。化合物的濃度響應(yīng)曲
線如圖 4。 在 FLIPR Tetra System、IonWorks BarracudaSystem 兩套系統(tǒng)上得到的 IC50 值進(jìn)行對比，如表 1 所示。
這三種檢測系統(tǒng)中的 IC50 值在半對數(shù) (1/2log) 范圍內(nèi)有較好的相關(guān)性，化合物效價的排序保持不變。
另外，有四個化 物被用來評估基于tuo離子的參照實(shí)驗(yàn)試劑盒 ( FluxOR 鉀離子通道實(shí)驗(yàn) ) 的性能 ( 圖 5 )。除了西沙必利 (cisapride) 之外，實(shí)驗(yàn)獲得的 IC50 值都相似的，如表 2 所 示。西沙必利通過 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒得到的 IC50 值更接近于 FLIPR Tetra System、IonWorksBarracuda System 兩套系統(tǒng)得到的值。FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒提供的平均信號窗口約為 225% ( % 確定為基線 )明顯高于 FluxOR 試劑盒的平均值 90%，每組 8 個樣本。為了進(jìn)行統(tǒng)計分析，能完全阻斷 hERG 通道響應(yīng)的 4uM 特非那定 (terfenadine) 作為陰性對照，陽性對照選擇引起Z大的hERG 通道響應(yīng)的刺激緩沖液。FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒獲得的更高 Z 因子得益于更低的孔間變異性和更寬的信號窗口 ( 圖 6 )。這可能是因?yàn)?FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒是一種真正的均質(zhì)性檢測實(shí)驗(yàn)，不需要清洗步驟或更換介質(zhì)，因此具有更低的孔間變異性。
結(jié)論
FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒使用均質(zhì)化、無需清洗的操作方案來測量鉀離子通道的功能活性。此研究中，我們使用一系列的參照的 hERG 阻滯劑來證明 FlexStation 3 酶標(biāo)儀的獲得的結(jié)果與使用 FLIPR Tetra System 和電生理方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有強(qiáng)烈的相關(guān)性。
另一組實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測試劑盒相比于競爭試劑盒產(chǎn)品，顯示了明顯更大的試驗(yàn)窗口和更高的 Z 因子。改進(jìn)的試驗(yàn)質(zhì)量聯(lián)合 FlexStation 3 多功能酶標(biāo)儀的中等通量能力或者 FLIPR Tetra System 的高通量能力，能夠在藥物發(fā)現(xiàn)的早期過程為 hERG 的特征分析提供一個有力的平臺。