簡介
來 自 Molecular Devices 公 司 的 FLIPRCalcium 檢測試劑盒使用敏感的鈣指示劑和專有的掩蔽染料，使研究人員能夠?qū)?G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCRs)、離子通道和其他鈣敏感靶點(diǎn)進(jìn)行高度敏感的熒光篩選。通過使用一種新的染料配方來進(jìn)一步增強(qiáng)鈣流檢測信號窗口，提高了測定的穩(wěn)定性，同時(shí)提供了更高的測定方案靈活性。因此，F(xiàn)LIPR Calcium 6 和 Calcium 6-QF 鈣試劑盒染料更適合于使用 16 通道移液頭以中等通量的 FlexStation3 多功能微孔板讀板機(jī)測量 384 孔板中的鈣流。結(jié)果與 FLIPRTetra 系統(tǒng)在高通量模式下獲得的結(jié)果相似。
檢測原理
如 圖 1 所 示 , FLIPR Calcium 6 檢 測 染 料進(jìn)入細(xì)胞的胞質(zhì)中。掩蔽技術(shù)不進(jìn)入細(xì)胞，但顯著減少了來自殘留細(xì)胞外的鈣指示劑、培養(yǎng)基和其他成分的背景熒光。FLIPRCalcium 6-QF 檢測試劑盒配方不含掩蔽技術(shù)，為淬滅敏感的靶標(biāo)或多色應(yīng)用提供了一種新的、靈活的選擇。提供了額外的檢測靈活性，在檢測中使用丙磺舒的要求Z小到?jīng)]有要求。某些細(xì)胞，如中國倉鼠卵巢(CHO) 細(xì)胞系中有一種陰離子交換蛋白，需要使用陰離子再攝取抑制劑，如丙磺舒，才能在胞質(zhì)中保留常用的鈣指示劑。獨(dú)特的 FLIPR Calcium 6 檢測試劑盒染料配方對此類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體具有更強(qiáng)的抗性，因此可能需要較少或不需要丙磺舒。

材料和方法
使用新的 FLIPR Calcium 6 和 Calcium 6-QF檢測試劑盒開發(fā)了檢測 HeLa 細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源性組胺受體的方法，然后與其他商業(yè)上可用的試劑盒進(jìn)行比較。采用‘Flex’讀數(shù)模式在 FlexStation 3 讀板機(jī)上測定鈣流。將保存在連續(xù)培養(yǎng)中的 HeLa 細(xì)胞以5000 個(gè)細(xì)胞 / 孔接種在含有 50 μL 生長培養(yǎng)基的黑壁、底透的 384 孔微孔板中，然后在 37℃、95% 濕度和 5% CO2 下過夜。第二天，細(xì)胞培養(yǎng)板按照制造商的建議 ( 包括水溶性丙磺舒 ) 加入適當(dāng)?shù)拟}試劑盒試劑，并根據(jù)制造商的方案孵育 60 或 120 分鐘。

優(yōu)勢
? 相比其他的鈣試劑和染料提供了Z大的信號窗口
? 可對包括內(nèi)源性、原代或干細(xì)胞靶標(biāo)進(jìn)行弱信號篩選
? 專利的一步法方案所使用的掩蔽技術(shù)大大減少了細(xì)胞外背景
? 對有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的抗性可使對陰離子再攝取抑制劑的需求Z小化

使用 FlexStation 3 讀板機(jī)集成的 16 通道移液器，用不同濃度的組胺 ( 從 100 μM 開始， 3 倍稀釋 ) 對細(xì)胞提出挑戰(zhàn)。使用優(yōu)化的參數(shù)在化合物添加前中后進(jìn)行 60 秒的熒光測定 ( 表 1 )。在拮抗劑研究中，使用FlexStation 3 讀板機(jī) 的機(jī)載移液系統(tǒng)加入嘧啶和利培酮 ( 從 30 μM 開 始，3 倍稀釋 )，并允許平衡 30 分鐘。然后用 15 μL/孔的組胺 ( EC80 濃度 ) 刺激細(xì)胞，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光強(qiáng)度的變化。
比較所用的鈣指標(biāo)是：
? FLIPR Calcium 6 檢測試劑盒(Molecular Devices)
? FLIPR Calcium 6-QF 檢測試劑盒(Molecular Devices)
? Fluo-4 Direct Calcium 檢測試劑盒(Life Technologies)
FlexStation 3 讀板機(jī)設(shè)置
細(xì)胞板在 FlexStation 3 讀板機(jī)中維持37℃。將化合物準(zhǔn)備在 Greiner 384 孔聚苯乙烯深孔板中，用 FlexStation 3 移液頭( 黑色 ) 進(jìn)行化合物轉(zhuǎn)移。具體參數(shù)見表 1。
結(jié)果和分析
以峰值熒光強(qiáng)度測定響應(yīng)。為了便于比較，將數(shù)據(jù)歸一化為基線上的 % 響應(yīng)，并表示為 n = 4 的平均 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。使用 SoftMax?
Pro 軟件將各組濃度響應(yīng)數(shù)據(jù)擬合到四參
數(shù)曲線上 ( 圖 2-5 )。