一種快速、高通量的病毒中和抗體檢測(cè)方法

新冠病毒的出現(xiàn)導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的新冠大流行，為了理解病毒的發(fā)病機(jī)理并開(kāi)發(fā)疫苗，亟需快速開(kāi)發(fā)多種研究工具。檢測(cè)病毒感染和疫苗接種后的免疫反應(yīng)對(duì)新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗體是免疫反應(yīng)和疫苗效價(jià)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監(jiān)測(cè)有效性的重要參數(shù)。 人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統(tǒng)方法例如蝕斑減少中和試驗(yàn) (PRNT) 來(lái)檢測(cè)。然而，該方法使用活的、具備感染性的病毒加入到靶細(xì)胞中，所以需要生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室以及耗時(shí)費(fèi)力的細(xì)胞培養(yǎng)。數(shù)據(jù)結(jié)果的分析耗費(fèi)時(shí)間并且不能自動(dòng)化。此外，假病毒中和試驗(yàn) (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，但此方法需要細(xì)胞培養(yǎng)和熒光成像來(lái)測(cè)得中和抗體活性，因此，也不適用于樣品的高通量篩選。

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采用重組 C 因子法在 Molecular Devices 四款不同型號(hào)多功能微孔板讀板機(jī)上進(jìn)行 定量檢測(cè)

在制藥和YL器械生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)污染物樣品的監(jiān)測(cè)是一個(gè)關(guān)鍵步驟。內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中，是一種常見(jiàn)的污染物，可引起發(fā)燒、炎癥、頭痛、惡心，甚至死亡。內(nèi)毒素的常規(guī)檢測(cè)方法是鱟試劑溶酶法 (LAL)，核心成分由鱟的血液中提取而來(lái)。在內(nèi)毒素存在的情況下，LAL 通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)凝固，可以通過(guò)比濁法或顯色法定量 ( 圖 1A )。這些方法涉及多個(gè)酶的步驟，并取決于鱟的可用性。 2021 年 2 月 5 日，國(guó)家林業(yè)和草原局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告，調(diào)整后的的《 國(guó)家ZD保護(hù)野生動(dòng)物名錄 》正式發(fā)布，將我國(guó)分布的鱟科動(dòng)物 ( ZG鱟、圓尾蝎鱟 ) 升級(jí)為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。ZG藥典 2020 年版 9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中指出，目前新的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法不斷出現(xiàn)，以適應(yīng)特殊品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的需要，或減少鱟試劑的使用量。如重組 C因子法 ( 見(jiàn)附 )、微量凝膠法等。

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采用 Quant-iT PicoGreen dsDNA 試劑盒對(duì) DNA 進(jìn)行靈敏的熒光定量

雙鏈 DNA 通常通過(guò)測(cè)定 DNA 溶液在 260 nm 處的吸光度在酶標(biāo)儀中進(jìn)行定量。然而，該方法在典型的光吸收酶標(biāo)儀上只能測(cè)量到約 250 ng/mL。對(duì)于涉及小樣本的生物應(yīng)用，如下一代測(cè)序和 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的定量，需要更敏感的方法。來(lái)自Thermo Fisher Scientific 公司的 Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測(cè)試劑盒對(duì) DNA 更特異，比傳統(tǒng)光吸收方法的靈敏度高約1000 倍。 如產(chǎn)品手冊(cè)所述，此實(shí)驗(yàn)在微孔板格式中采用單一染料濃度的動(dòng)態(tài)范圍從 250 pg/mL 到 1000 ng/mL。在這里，我們證明了使 用 Molecular Devices 公司 SpectraMax?酶標(biāo)儀和 Quant-iT PicoGreen 實(shí)驗(yàn)，用戶可以可靠地測(cè)量低 至 50 pg/mL 的雙鏈 DNA 濃度。為了ZD化實(shí)驗(yàn)的靈敏度，需要使用ZJ的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。

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使用 SpectraMax 微孔板讀板機(jī)進(jìn)行 HTRF IP-One Gq 檢測(cè)

HTRF? 是 Cisbio 公司開(kāi)發(fā) 的用于檢 測(cè) 生物 分子相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 1。它將熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 技術(shù)與時(shí)間分辨(TR) 熒光技術(shù)相結(jié)合，可以消除熒光壽命較短的背景熒光。該 檢 測(cè)方法 使 用銪 (Eu3+) 或 鋱 (Lumi4 ? -Tb) 的穴狀 化合 物作為供體，熒光團(tuán) ( XL665 或小分子 d2 ) 作為受體。當(dāng)供體和受體距離足夠近時(shí)，供體被一個(gè)能量源激發(fā)，可以引發(fā)能量轉(zhuǎn)移到受體，使其在特定波長(zhǎng)發(fā)出熒光。 在 這 里， 我 們 展 示 了 如 何 使 用 SpectraMax?i3x 和SpectraMax?iD5 多功能微孔 板讀 板機(jī) 應(yīng) 用 HTRF 技術(shù)進(jìn) 行Gq- 偶聯(lián)受體的分析。G 蛋白偶聯(lián)受體的分析主要通過(guò)檢測(cè)cAMP 和 IP3 這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的升高。Cisbio 公司的 IP-One Gq 試劑盒通過(guò)檢測(cè) IP3 的穩(wěn)定下游代謝產(chǎn)物——磷酸肌醇 (IP1) 的積累，為鈣離子檢測(cè)提供了一種替代方法。

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用 cAMP-Gs HiRange HTRF 法檢測(cè) GPCR 活性

HTRF? 是由 Cisbio 開(kāi)發(fā)的用于檢測(cè)生物分子相互作用的通用技術(shù)。它將熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 技術(shù)與熒光的時(shí)間分辨(TR) 測(cè)量相結(jié)合，可以消除短壽命的背景熒光。該測(cè)定使用供體和受體熒光團(tuán)，它們用于標(biāo)記要研究其結(jié)合的蛋白質(zhì)或其他生物分子。 當(dāng)兩個(gè)生物分子相互結(jié)合時(shí)，供體和受體就靠 在一起了。能量源 ( 例如閃光燈 ) 對(duì)供體的激發(fā)觸發(fā)能量轉(zhuǎn)移到受體，受體繼而在給定波長(zhǎng)發(fā)射特定熒光。 HTRF 使 用四種特定的熒光團(tuán)，它們可以組合形成相容的供體 - 受體 TR-FRET 對(duì)。 供體是穴狀銪 (Eu3+) 和鋱穴狀化合物(Lumi4 ? -Tb)，它們的長(zhǎng)壽命熒光使其可用于時(shí)間分辨熒光分析。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了兩種受體用于 HTRF 分析，XL665 和 d2。兩者的激發(fā)光譜都與 HTRF 供體的發(fā)射光譜重疊，在 665 nm處的發(fā)射峰落在供體不顯著發(fā)射的區(qū)域內(nèi)。Z初的 HTRF 受體 XL665 是一種從紅藻中純化的藻膽蛋白色素。 第二代受體d2 是改良的別藻藍(lán)蛋白，比 XL665 小 100 倍，旨在緩解基于XL665 的檢測(cè)可能出現(xiàn)的空間位阻問(wèn)題。

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