簡(jiǎn)介
ScanLater Western Blot Protein Ladder 是 ScanLater Western Blot 檢 測(cè)系 統(tǒng) 的重 要 組 成部分。該 protein ladder的主要應(yīng)用包括蛋白質(zhì)分子量的估計(jì)，凝膠電泳的可視化，以及從凝膠到印跡轉(zhuǎn)移過(guò)程的評(píng)價(jià)。ScanLater Western Blot Protein Ladder 由 7 個(gè)生物素化的重組蛋白以及 3 個(gè)預(yù)先染色的標(biāo)記蛋白組成。生物素化蛋白的檢測(cè)是通過(guò)在二抗步驟的印跡中加入銪標(biāo)記的鏈霉親和素來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 在 SpectraMaxi3 或 SpectraMax Paradigm 多功能微孔板讀板機(jī)上，使用ScanLater Western Blot 檢測(cè)卡盒讀取印跡。
ScanLater Western Blot Protein Ladder
ScanLater Western Blot Protein Ladder 由 7 個(gè) 生物素化的重組蛋白組成，分別為 10、20、40、50、80、100 和 140 kD。用銪標(biāo)記的鏈霉親和素孵育的印跡檢測(cè)它們，當(dāng)用 ScanLaterWestern blot 檢測(cè)盒讀取時(shí)，它們顯示為淺色條帶 ( 圖 1, 左 )。此外，在 18、31 和 70 kD 處有三個(gè)可見(jiàn)的預(yù)染色標(biāo)記蛋白 ( 圖1，右 )。這些藍(lán)色條帶在電泳凝膠和轉(zhuǎn)移后的印跡上可見(jiàn)。當(dāng)用掃描 Western Blot 檢測(cè)系統(tǒng)讀取 ladder 時(shí)，它們也被視為暗條帶。
生物素化 ladder 蛋白的分子量與其在凝膠上的遷移距離之間的線性關(guān)系在圖 2 中與參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較。

優(yōu)點(diǎn)
? 一套標(biāo)準(zhǔn)包含了可視化凝膠和加入了 TRF 檢測(cè)的印跡排列的標(biāo)記
? 生物素化蛋白
? 檢測(cè)蛋白的分子量可以被估計(jì)
? 不需要混合或加熱

圖 1 ScanLater Western Blot Protein Ladder。 白色條帶是生物素化的蛋白，用來(lái)估計(jì)印跡蛋白的分子量。 它們與銪 - 鏈霉親和素孵育后被檢測(cè)，并在 ScanLater Western Blot 檢測(cè)系統(tǒng)上讀取。暗條帶是預(yù)先染色的蛋白質(zhì)，用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)電泳、印跡定位和評(píng)估轉(zhuǎn)移效率的進(jìn)展。在這些過(guò)程中，它們以藍(lán)色帶的形式出現(xiàn)。

圖 2 遷移 vs. 分子量。 在 ScanLater Western Blot Protein Ladder 中，7 個(gè)蛋白的遷移距離被繪制出來(lái)，并作為它們各自的分子量的函數(shù)進(jìn)行擬合。線性關(guān)系類似于 Sigma cat. # B2787 的參考產(chǎn)品。

ScanLater Western Blot 檢測(cè)方法
ScanLater Western Blot 工作流程遵循標(biāo)準(zhǔn)的凝膠上樣和印跡方法，直到二抗孵育步驟。與感興趣的蛋白樣品一起，簡(jiǎn)單地將其中一條泳道加載到帶有 4 μL ScanLater Western Blot protein Ladder 的凝膠上。ladder 不需要加熱或其他準(zhǔn)備。用一抗孵育后，膜進(jìn)行封閉和洗滌，然后用 1:5000 銪 - 鏈霉親和素和 1:5000 銪 - 二抗孵育，銪 - 鏈霉親和素與蛋白 ladder 結(jié)合，且銪 - 二抗特異性地與一抗結(jié)合的感興趣蛋白結(jié)合。使用 ScanLater Western Blot 檢測(cè)卡盒在SpectraMax Paradigm或 SpectraMax i3 多功能微孔板讀板機(jī)上掃描膜，該檢測(cè)卡盒利用時(shí)間分辨熒光 (TRF) 檢測(cè)銪 (Eu)。
TRF 檢測(cè)顯著降低了來(lái)自自發(fā)熒光或其他短壽命發(fā)射光的背景噪聲。沒(méi)有化學(xué)發(fā)光或標(biāo)準(zhǔn)熒光檢測(cè)常見(jiàn)的相機(jī)光暈 ; 因此，該系統(tǒng)提供高信噪比的銳利條帶。 該方法不涉及酶反應(yīng)，因此消除了蛋白質(zhì)定量固有的可變性。 銪是抗光漂白的，所以western blot 信號(hào)在幾周到幾個(gè)月的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，這使得膜的重復(fù)讀取成為可能。ScanLater Western Blot 檢測(cè)系統(tǒng)，包括 ScanLater Western Blot Protein Ladder，是一個(gè)簡(jiǎn)單、靈敏、穩(wěn)定的平臺(tái)，在多功能酶標(biāo)儀中提供卓越的蛋白分析能力。
已知蛋白質(zhì)的可視化估計(jì)
白細(xì)胞介素 -17 和熱休克蛋白的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)也證明了使用ScanLater Western Blot Protein Ladder 來(lái)估計(jì)分子量。
白細(xì)胞介素 -17
將白介素 -17 (IL-17) 上樣到 4-20% 梯度凝膠中，1X 運(yùn)行緩沖液中，運(yùn)行 30 分鐘。在同一凝膠上也上樣了 ScanLater Western Blot Protein Ladder。
將蛋白轉(zhuǎn)移到 Immobilon-FL 膜上，用大鼠抗 -IL-17 作為探針過(guò)夜，然 后用 1:5000 ScanLater 銪 - 抗 - 大鼠 IgG 和 1:5000ScanLater 銪 - 抗 - 鏈霉親和素抗體孵育 1 小時(shí)。如圖 3a 所示，用帶有 ScanLater Western blot 檢測(cè)卡盒的 SpectraMax i3 多功能微孔板讀板機(jī)對(duì)洗滌和干燥好的印記進(jìn)行掃描。使用ScanLater Western Blot Protein Ladder 估計(jì) IL-17 的分子量約為 14 kD，而公布的分子量范圍約為 15 kD。

圖 3 (3a) IL-17 的分子量估算。使用 ScanLater Western Blot Protein Ladder 估算 IL-17 的分子量。(3b) Western blot 顯示 HSP70 的升高。Western blot 顯示，當(dāng)細(xì)胞暴露在高于正常溫度的環(huán)境中時(shí)，HSP70 蛋白含量會(huì)增加。估計(jì)其分子量約為 70 kD。

熱休克蛋白
熱休克蛋白 (HSP70) 是在高于正常培養(yǎng)溫度的細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生的。在本研究中，CHO-K1 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞暴露于45℃ 45-90 分鐘后 6 小時(shí)采集細(xì)胞提取物。每個(gè)細(xì)胞樣品提取液 5μL，凝膠梯度4-20%。4 μL 的 ScanLater Western Blot Protein Ladder 也被上樣到凝膠上。轉(zhuǎn)移后，封閉印記，洗滌并用小鼠抗 -HSP70 標(biāo)記過(guò)夜，然后用銪 - 抗 - 小鼠 IgG 孵育 1 小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)將 ladder 與抗銪 - 鏈霉親和素單獨(dú)孵育。在圖 3b 所示的反向圖像中，由于染色淬滅了TRF 信號(hào)，預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)出蒼白的條帶。兩種細(xì)胞系的 HSP70 均隨溫度升高而升高。通過(guò)與 ScanLater Western Blot Protein Ladder 的比 較，估計(jì) HSP70 蛋白的大小約為 70 kD。
總結(jié)
ScanLater Western Blot Protein Ladder 可以估計(jì)蛋白質(zhì)的大小，如圖 1 中的亮條帶所示，同時(shí)在電泳過(guò)程中以及轉(zhuǎn)移過(guò)程中和之后的凝膠上提供可見(jiàn)的指標(biāo)。 使用該系統(tǒng)，用戶可以遵循電泳和印跡工作流程，這是為他們的應(yīng)用優(yōu)化。與銪 - 鏈霉親和素和銪 - 二抗 混合孵育，可以在 TRF 模式下用
SpectraMax i3 或 Paradigm 多功能微孔板讀板機(jī)對(duì) ladder和感興趣的蛋白進(jìn)行低本底檢測(cè)。圖像可在 SoftMax Pro 軟件中生成，包括集成的可導(dǎo)出到一個(gè)自定義宏的 Excel 中以進(jìn)行定量分析。 隨著 ScanLater Western Blot Protein Ladder 的加入，ScanLater Western Blot 檢測(cè)系統(tǒng)在多功能酶標(biāo)儀中提供了卓越的靈敏度和蛋白分析能力。