介紹
Transcreener HTS 是一種通用的，高通量的生化測定平臺，該測定法是基于二磷酸核苷酸 (ADP/GDP) 的檢測，二磷酸核苷酸可由數(shù)千種激酶催化而形成，其中很多激酶的催化共價(jià)調(diào)節(jié)反應(yīng)對細(xì)胞的信號傳導(dǎo)至關(guān)重要，并作為靶標(biāo)在藥物發(fā)現(xiàn)中具有重要價(jià)值。
TranscreenerFI 測定法是一步競爭性免疫測定法，直接檢測帶有紅色熒光 (FI) 的核苷酸的熒光強(qiáng)度。該測定體系中使用的是與高特異性單克隆抗體 - 淬滅劑偶聯(lián)物結(jié)合的紅色示蹤劑。目標(biāo)酶產(chǎn)生的二磷酸核苷酸置換了抗體 - 淬滅劑偶聯(lián)物中的示蹤劑，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加 ( 圖 1 )。 使用紅色示蹤劑可Z大程度地減少熒光化合物和光散射的干擾，Transcreener FI 測定法是專為 HTS 設(shè)計(jì)的，采用一步添加，混合和讀取的測定模式。
驗(yàn)證要求
實(shí)現(xiàn) Transcreener HTS 分析優(yōu)勢的一個(gè)關(guān)鍵因素是獲取數(shù)據(jù)的酶標(biāo)儀的正確設(shè)置，是否正確選擇光學(xué)組件和其他參數(shù)設(shè)置會影響儀器對任何給定測定的靈敏度。通過運(yùn)行 10 μM ATP / ADP 標(biāo)準(zhǔn)曲線 (24次重復(fù) ) 來確定 Transcreener HTS 檢測性能的關(guān)鍵儀器參數(shù)，并使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線模擬酶促反應(yīng)。從 10μM 濃度的 ATP 開始， ADP 的量慢慢增加，ATP 的量則按比例的減少，使腺嘌呤核苷酸總濃度保持在10 μM。調(diào)整積分時(shí)間來實(shí)現(xiàn) Z' ＞ 0.5 的質(zhì)量要求。如果 10μM ATP 在 10% 的轉(zhuǎn)化率下能達(dá)到 Z' 值 ＞ 0.7，則表明該儀器能夠用于 Transcreener FI 檢測。
樣品 FI 的標(biāo)準(zhǔn)曲線
隨著 ADP:ATP 比例的增加，結(jié)合示蹤劑與游離示蹤劑的比例降低，從而導(dǎo)致 RFU值整體增加。使用 SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機(jī)讀取含有 15 點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定板，該曲線由 ADP:ATP 的比值 所 代表的轉(zhuǎn)化率，范圍在 1％ 至 100％。

優(yōu)勢
? 一步添加，混合和讀取的測定形式，非常適用于高通量篩選
? 使用 10 μM ATP 在 10% 的轉(zhuǎn)化率下達(dá)到出色的數(shù)據(jù)質(zhì)量 Z′＞0.7
? 三分鐘或更短的時(shí)間內(nèi)讀完 384孔板

材料
? Transcreener? ADP2 FI (3013)
? Transcreener? GDP FI (3014)
? ATP/ADP 組合液 : 10 mM MgCl2, 20 mMHEPES, pH 7.5, 0.01% Brij-35 和 ATP/ADP ( 結(jié)合成恒定的腺嘌呤濃度 10 μM )
? ADP 檢 測 混 合 液 : 1X Stop & DetectBuffer B, 8 nM ADP Alexa594 示蹤劑和10 μg/mL ADP2 AntibodyIRDye?QC-1( 抗體 - 淬滅劑的耦合物 )
? 游離示蹤劑 – 1X Stop & Detect Buffer B和 8 nM ADP Alexa594 示蹤劑
? 緩沖空白液 – 1X Stop & Detect BufferB 和 10 μg / mLADP2 Antibody -IRDye?QC-1
方法
1. 在 384 孔板的整行中分配 10 μL 的每種 ATP / ADP 組合濃度的組合液。
2. 在這些行中加入 10 μL ADP 檢測混合液。
3. 將 10 μL 的 10 μM ATP / 0 μM ADP 組合液分配到 P 行。
4. 將 10 μL 的游離示蹤劑分配到 P1-P12孔中。
5. 將 10 μL 緩沖液空白液分配到孔P13-P24 中
有關(guān)如何制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的詳細(xì)步驟，請參 閱 相 應(yīng) 的 Transcreener  技術(shù)手冊 ( https : // www . bellbrooklabs .
com/technical-resources/technicalmanuals/)
微孔板讀板機(jī)
? SpectraMax iD3 多功能讀板機(jī)
? SpectraMax iD5 多功能讀板機(jī)
SpectraMax iD5 可選擇配件：
? 565 nm 帶寬 30 nm 的熒光濾光片(Molecular Devices cat. #6590-0131)；
? 625 nm 帶寬 35 nm 的熒光濾光片(Molecular Devices cat. #6590-0108)
使用 SpectraMax iD5 酶標(biāo)儀的四光柵系統(tǒng)進(jìn)行波長選擇的熒光檢測與使用專門用于 Alexa594 示蹤劑的濾光片對的熒光檢測行了比 較，SpectraMax iD3 酶標(biāo)儀僅使用四光柵系統(tǒng)檢測熒光。

儀器設(shè)置
SpectraMax iD3/ iD5 酶標(biāo)儀配 合SoftMaxPro 數(shù)據(jù)采集和分析軟件，按照下面的步驟，使用優(yōu)化的設(shè)置讀取微孔板：
1. 打開 SoftMax Pro 軟件，“ 讀取模式 ”選擇“FI”，“ 讀取類型 ”選擇“Endpoint”。
2. 在“ 波長 ”選 項(xiàng)分別輸入激發(fā)波長為575 nm，發(fā)射波長為 620 nm。如果使用濾光片 ( 僅在 SpectraMax iD5 酶 標(biāo)儀上提供 )，請安裝 565/30 激發(fā)濾光片和 625/35 發(fā)射濾光片，然 后從激發(fā)和發(fā)射波長的下拉菜單中選擇這個(gè)濾光片對。
3. 根據(jù)要檢測的微孔板選擇微孔板的“ 類型 ”，待測的微孔板區(qū)域選擇“ 讀數(shù)區(qū)域 ”。
4. 將“ PMT 增 益 ”設(shè) 置為“ 自動 ”，儀器默認(rèn)是頂部讀取 ( 請勿選中“ 從底部讀取 ”框 )
5. 如果使用光柵系統(tǒng)， 則將積分時(shí)間設(shè)置 為 50-200 ms ( 增加積分時(shí)間可提高 10% 轉(zhuǎn)化的 Z ′ 值 )； 如果使用SpectraMax iD5 讀板機(jī)的濾光片對，則設(shè)置為 50 ms。
6. Z初進(jìn)行測定時(shí)，應(yīng)始終優(yōu)化微孔板和讀數(shù)高度。只要體積，微孔板類型，示蹤劑和濃度保持不變，相同的儀器設(shè)置可用于讀取后續(xù)板。 表 1 總結(jié)了上述設(shè)置。
結(jié)論
在本文中，我們驗(yàn)證了使用 SpectraMax iD3和 iD5 多功能讀板機(jī)進(jìn)行 Transcreener FI測定法的優(yōu)越性能，使用應(yīng)用程序說明中建議的儀器參數(shù)優(yōu)化了設(shè)置，可以實(shí)現(xiàn)出色的數(shù)據(jù)質(zhì)量 Z′ > 0.7