簡介
HTRF 是 Cisbio 公司開發(fā) 的用于檢 測 生物 分子相互作用的實驗技術(shù) 1。它將熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 技術(shù)與時間分辨(TR) 熒光技術(shù)相結(jié)合，可以消除熒光壽命較短的背景熒光。該檢測方法使用銪 (Eu3+) 或 鋱 (Lumi4 ? -Tb) 的穴狀化合物作為供體，熒光團 ( XL665 或小分子 d2 ) 作為受體。當(dāng)供體和受體距離足夠近時，供體被一個能量源激發(fā)，可以引發(fā)能量轉(zhuǎn)移到受體，使其在特定波長發(fā)出熒光。
在這里， 我們展示了如何使 用 SpectraMax i3x 和SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機應(yīng)用 HTRF 技術(shù)進行Gq- 偶聯(lián)受體的分析。G 蛋白偶聯(lián)受體的分析主要通過檢測cAMP 和 IP3 這兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的升高。Cisbio 公司的 IP-One Gq 試劑盒通過檢測 IP3 的穩(wěn)定下游代謝產(chǎn)物——磷酸肌醇 (IP1) 的積累，為鈣離子檢測提供了一種替代方法 ( 圖 1 )。

在氯化鋰 (LiCl) 存在的情況下，IP1 的降解被抑制并在信號細(xì)胞中積累 ( 圖 1 )。在 IP-One HTRF 實驗中，帶有 d2 受體的IP1 可以與細(xì) 胞 產(chǎn)生的天 然 IP1 競爭，結(jié)合帶有穴狀化合物供體的 IP1 特異性單克隆抗體。細(xì)胞產(chǎn)生的未標(biāo)記 IP1 ( 天然 IP1 ) 的增加會導(dǎo)致 TR-FRET 的中斷和 HTRF 信號強度的減弱( 圖 2 )2。IP-One 檢測可用于表征貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞中作用于 Gq- 偶聯(lián)受體的化合物。

優(yōu)勢
? 經(jīng) HTRF 認(rèn)證確保儀器性能
? 高靈敏度和寬動態(tài)范圍
? 分析功能強大，適用于高通量分析 (HTS) 平臺

實驗材料
? IP-One Gq 試劑盒 , 1000 次 (Cisbio cat. #62IPAPEB)
? 白色 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
? SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #I3X)
? HTRF 檢測卡盒 (Molecular Devices cat. #0200-7011)
? SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #ID5)
? HTRF 檢測系統(tǒng) ( Molecular Devices cat. #6590-0144; 包含增強型 TRF 模塊 , 激發(fā)和發(fā)射濾片 )

方法
如產(chǎn)品使用說明書所示 3，IP1 標(biāo)準(zhǔn)品制備的Z終濃度范圍為 1.9nM 至 7700 nM。包括一個沒有任何未標(biāo)記 IP1( Z大 FRET ) 的陽性對照和一個沒有 IP1 或抗 IP1-d2 抗體的陰性對照。如圖 3所示，試劑的Z終用量為每孔 20 μL。將微孔板在室溫下孵育 1小時，使用 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機讀取數(shù)據(jù)，優(yōu)化設(shè)置如表 1 所示。
調(diào)整延 遲時間，間隔時間和脈沖次數(shù)以優(yōu)化設(shè)置，直到△ F％ ( 請參見下面的數(shù)據(jù)分析 ) 顯著增加。 并且可以將表 1 中列出的優(yōu)化設(shè)置應(yīng)用到同一型號的任何酶標(biāo)儀上，即下面列出的 SpectraMax iD5 微孔板讀板機的設(shè)置可以用于任何一臺SpectraMax iD5 讀板機。但是，當(dāng)使用新類型的微孔板 ( 或大量微孔板 ) 或試劑體積發(fā)生改變時，都應(yīng)執(zhí)行微孔板優(yōu)化和讀數(shù)高度調(diào)整，以使讀板機的光學(xué)系統(tǒng)對準(zhǔn)化驗板。 這樣可以確保Z小的誤差，以及Z佳的檢測靈敏度和動態(tài)范圍。

數(shù)據(jù)分析
HTRF 分析使用 Cisbio 公司的專利比值測定法，該方法基于檢測到的兩個發(fā)射波長。將供體在 616 nm 處的發(fā)射作為內(nèi)參，受體在 665 nm 處的發(fā)射作為被測生物反應(yīng)的指示。這種比值測定方法可以減少孔間誤差并消除復(fù)合干擾。在下面第 4 步中計算的 △ F 反映了分析背景的信號，適用于批間分析的比較。根據(jù) 665 nm/616 nm 比值計算得到的結(jié)果用 △ F 表示如下 :

使用 SoftMax Pro 軟件生成和分析數(shù)據(jù)，該軟件包含預(yù)先配置的 HTRF 協(xié)議，可以簡化使用上述方法進行檢測和分析的流程。
結(jié)果
在 SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5 微孔板讀板機上使用SoftMax Pro 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行 4 參數(shù)曲線擬合 ( 圖4)，結(jié)果見表 2。使用 EC50 評估該測定方法的適用性，EC50 值應(yīng)低于 150 nM。對于兩個讀板機，EC50 值均低于 85 nM，處于可接受范圍內(nèi)。Cisbio 將可接受的信噪比定義為≥ 20，兩個讀板機都滿足這個標(biāo)準(zhǔn)。憑借這些結(jié)果以及所有標(biāo)準(zhǔn)的 CV值均低于 6 ％， 這些實驗結(jié)果表明利用 SpectraMax i3x 和SpectraMax iD5 讀板機進行 IP-One 檢測具有高靈敏度和寬動態(tài)范圍。

結(jié)論
SpectraMax i3x 和 iD5 微孔板讀板機分別配備 HTRF 認(rèn)證的檢測卡盒或 HTRF 認(rèn)證的檢測系統(tǒng)。根據(jù) Cisbio 的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)，兩個讀板機都具備檢測 IP1 濃度的能力。使用預(yù)置 HTRF 協(xié)議的 SoftMax Pro 軟件可以簡化數(shù)據(jù)采集和分析流程。