雙光子熒光和二次諧波

雙光子熒光(2PEF)和二次諧波(SHG)是研究生物樣品方面的多光子成像技術(shù)。兩種成像技術(shù)都利用飛秒脈沖紅外激發(fā)光產(chǎn)生較短波長的光來對樣品進(jìn)行成像，通過不同的物理過程實現(xiàn)（圖1）。在2PEF中，兩個紅外光子同時被熒光團(tuán)吸收，使其進(jìn)入激發(fā)態(tài)，然后輻射弛豫，發(fā)射較短波長的熒光。相比之下，SHG不是吸收和發(fā)射過程，而是兩個紅外光子結(jié)合在具有特定對稱性的非線性光學(xué)材料中，產(chǎn)生恰好是入射光子一半波長的新光子。這兩種技術(shù)都利用紅外光的較低散射和吸收，來實現(xiàn)深入組織的成像。在本文中，天美愛丁堡儀器公司的RMS1000共焦顯微拉曼光譜儀，使用2PEF和SHG對小鼠腸道的組織切片進(jìn)行成像。

圖1 雙光子熒光 VS 二次諧波

樣本：使用 Alexa Fluor? 568染色的小鼠腸道組織切片；RMS1000 配備電動 XYZ 載物臺和 40x NA = 0.75 物鏡；對于光學(xué)成像，RMS1000 配備了背照式CCD相機（可用于壽命成像）；以及，光子計數(shù)混合光電檢測器和時間相關(guān)單光子計數(shù) (TCSPC)器。2PEF 和 SHG 都需要非常高的激發(fā)強度，可使用鎖模飛秒脈沖激光器實現(xiàn)的。RMS1000具有外部激光器耦合端口，可將飛秒激光器耦合到顯微鏡光路中。

2PEF和SHG的CCD相機光譜成像

使用RMS1000的CCD相機對小腸組織切片進(jìn)行光譜成像。

樣品的面積為900μm×800μm，空間分辨率為2μm。樣品在1040nm、80MHz的頻率下被激發(fā)，用CCD相機同時獲得2PEF和SHG信號。多光子成像如圖2a所示。Alexa Fluor?568染料在630 nm處的2PEF成像顯示為藍(lán)綠色，顯示出腸絨毛的結(jié)構(gòu)。粉色顯示的區(qū)域是腸壁附近的纖維膠原蛋白，在520nm處的SHG信號。SHG只發(fā)生在非中心對稱的分子結(jié)構(gòu)中，纖維膠原蛋白是一種常見的具有這種生物結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，可以引起強烈的SHG信號響應(yīng)。圖像中的每個點都有對應(yīng)的光譜信號，A點和B點的光譜，如圖2b所示。在A點，只有來自Alexa Fluor?568染料的2PEF信號，一個寬的發(fā)射峰在630 nm處，而在B點有另一個520nm的尖峰，這是SHG信號。通過分別繪制2PEF和SHG在630 nm和520 nm處的光譜強度，得到了圖2a中的彩色圖像。

圖2 （a）用Alexa Fluor?568染色的小鼠腸道切片的2PEF和SHG圖像

（b）從圖像中選取兩點的光譜圖

混合光電檢測器的2PEF壽命成像

通過雙光子熒光壽命成像可以獲得更多的信息。對于壽命成像，使用脈沖選擇器將激光的頻率降低到20 MHz，以確保脈沖之間的完全熒光衰減。利用光子計數(shù)混合光電檢測器上的TCSPC，采樣相同的900μm x 800μm區(qū)域，并記錄了每個點的熒光衰減。使用RMS1000 Ramacle?軟件對每個熒光衰減進(jìn)行指數(shù)模型擬合，得到的壽命圖像如圖3a所示。壽命圖像顯示，與絨毛相比，腸壁附近的腸隱窩的熒光壽命降低；這是一個可以從壽命成像中獲得更多樣本信息的例子。

圖3 （a）用Alexa Fluor?568染色的小鼠腸切片的2PEF壽命圖像

（b）從圖像中選取兩點的熒光衰減

結(jié)論

采用RMS1000共聚焦顯微拉曼光譜儀的多光子顯微成像技術(shù)，可以對小鼠腸道切片樣本進(jìn)行成像。RMS1000配備一個外部飛秒激光器和TCSPC，用于先進(jìn)的光譜和時間分辨的多光子成像技術(shù)，如2PEF和SHG，增強了拉曼成像的核心能力。

愛丁堡共聚焦顯微拉曼光譜儀

RMS1000

愛丁堡RMS1000是一款科研級、模塊化共聚焦顯微拉曼光譜儀，可以實現(xiàn)超高的光譜分辨率、空間分辨率和靈敏度。RMS1000的設(shè)計基于強大的專業(yè)知識和經(jīng)典光路原理構(gòu)型，結(jié)合現(xiàn)代光學(xué)設(shè)計，注重功能、精度和速度，在模塊化和擴展性上形成獨具一格的現(xiàn)代化顯微拉曼光譜儀。RMS1000可以配置多達(dá)5個集成的窄帶激光器，擴展外部激光器，可以實現(xiàn)拉曼成像、雙光子成像、二次諧波成像、熒光壽命成像等功能，獲得樣品的全方位信息，適用于生物、組織切片類樣品的無損、深層次分析。