介紹
HTRF 是由 Cisbio 開發(fā)的用于檢測生物分子相互作用的通用技術(shù)。它將熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 技術(shù)與熒光的時間分辨(TR) 測量相結(jié)合，可以消除短壽命的背景熒光。該測定使用供體和受體熒光團(tuán)，它們用于標(biāo)記要研究其結(jié)合的蛋白質(zhì)或其他生物分子。 當(dāng)兩個生物分子相互結(jié)合時，供體和受體就靠在一起了。能量源 ( 例如閃光燈 ) 對供體的激發(fā)觸發(fā)能量轉(zhuǎn)移到受體，受體繼而在給定波長發(fā)射特定熒光。
HTRF 使用四種特定的熒光團(tuán)，它們可以組合形成相容的供體 - 受體 TR-FRET 對。 供體是穴狀銪 (Eu3+) 和鋱穴狀化合物(Lumi4 ? -Tb)，它們的長壽命熒光使其可用于時間分辨熒光分析。已經(jīng)開發(fā)了兩種受體用于 HTRF 分析，XL665 和 d2。兩者的激發(fā)光譜都與 HTRF 供體的發(fā)射光譜重疊，在 665 nm處的發(fā)射峰落在供體不顯著發(fā)射的區(qū)域內(nèi)。Z初的 HTRF 受體 XL665 是一種從紅藻中純化的藻膽蛋白色素。 第二代受體d2 是改良的別藻藍(lán)蛋白，比 XL665 小 100 倍，旨在緩解基于XL665 的檢測可能出現(xiàn)的空間位阻問題。

HTRF cAMP HiRange 試劑盒對細(xì)胞樣品中的環(huán)腺苷 酸(cAMP，cyclic adenosine 3’, 5’–monophosphate) 進(jìn)行定量。 cAMP 是 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵第二信使。配體與 GPCR 結(jié)合后，會發(fā)生構(gòu)象變化，激活受體，進(jìn)而激活 G 蛋白。 進(jìn)一步的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)取決于激活的 G 蛋白的類型。 Gs 蛋白的活化導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶對 cAMP 的上調(diào)。細(xì)胞產(chǎn)生的游離 cAMP 與 d2 標(biāo)記的 cAMP 競爭結(jié)合抗 cAMP穴狀化合物，因此細(xì)胞 cAMP 的增加導(dǎo)致 FRET 的減少，這可以通過 665 nm 發(fā)射的熒光減少來檢測 ( 圖 1 )。

優(yōu)勢
? 擁有 HTRF 兼容性認(rèn)證，確保儀器性能
? 高度穩(wěn)定、均質(zhì)的高通量檢測
? 使用預(yù)設(shè)的 SoftMax Pro 軟件方法更快地獲得結(jié)果

在這里，我們展示了如何用 SpectraMax? i3x 和 SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī) ( 均通過 Cisbio 的 HTRF 兼容性認(rèn)證 ) 對 GPCR 活性進(jìn)行穩(wěn)健、免洗的檢測。

材料
? cAMP Gs HiRange 試劑盒( 1000 次測試，Cisbio cat.#62AM6PEB )
? 白色低體積 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
? SpectraMax i3x 多 功 能 微 孔 板 讀 板 機(jī) (Molecular Devicescat. #i3x)
? SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī) (Molecular Devicescat. #iD5)
? 用于 SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機(jī)的 HTRF 檢測卡盒(Molecular Devices cat. #0200-7011)
? 用于 SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)的 HTRF 檢測系統(tǒng)( Molecular Devices cat. #6590-0144，包括增強(qiáng)型 TRF 模塊和 HTRF 濾片 )
方法
cAMP Gs HiRange 試劑盒由 Cisbio 提供。 如試劑盒包裝插頁所示，制備終濃度范圍為 0.17 nM 至 2800 nM 的cAMP 標(biāo)準(zhǔn)品。包括不含 cAMP( Z大 FRET ) 的陽性對照和不含 cAMP或 cAMP-d2 的陰性對照。 將試劑分配至低體積 384 孔微孔板中，每孔終體積 20 μL，如表 1 所示。

將孔板在室溫下加蓋孵育一小時。 時間分辨熒光在SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5 微孔板讀板機(jī)上使用SoftMax Pro 軟件中的預(yù)設(shè)方法進(jìn)行測量 ( 有關(guān)儀器特定設(shè)置，請參見表 2 和表 3 )。在 SpectraMax i3x 和 SpectraMaxiD5 讀板機(jī)上進(jìn)行了微孔板優(yōu)化和讀取高度調(diào)整，以確保Z佳的檢測靈敏度和動態(tài)范圍。
數(shù)據(jù)分析
基于檢測到的兩個發(fā)射波長，HTRF 實驗使用 Cisbio 專利的比值算法進(jìn)行分析，分析步驟如下所示。 供體在 616 nm 的發(fā)射用作內(nèi)參，受體在 665 nm 的發(fā)射用作所測定生物反應(yīng)的指示。 這種比率測量減少了孔與孔之間的差異并消除了化合物干擾。 Delta F，在下面的步驟 4 中計算，反映了檢測的信噪比，可用于內(nèi)部測定的比較。 結(jié)果由 665 nm/616 nm 比率計算得出，并以 Delta F 表示如下：

使用 SoftMax Pro 軟件生成和分析數(shù)據(jù)，該軟件包含多個預(yù)設(shè)的 HTRF 方法，其中包含上述步驟以簡化檢測和分析。
實驗結(jié)果
數(shù)據(jù)如上所述進(jìn)行分析，并使用 SoftMax Pro 軟件使用 4 參數(shù)曲線擬合繪制圖表 ( 圖 2 )。使用表 2 ( SpectraMax i3x 讀板機(jī) ) 或表 3 ( SpectraMax iD5 讀板機(jī) ) 中指示的讀板機(jī)設(shè)置獲得了Z佳結(jié)果。這些設(shè)置是與 Cisbio 合作優(yōu)化的，以證明讀板機(jī)與 HTRF 兼容。 更改延遲時間、檢測時間或脈沖數(shù)可能會導(dǎo)致不太理想的結(jié)果。
Cisbio 指出，使用 EC50 和信噪比來評估方法的適用性，二者應(yīng)分別 ≤ 25 nM 和 ≥ 20。兩種讀板機(jī)的 EC50 值都非常相似，并且在可接受的范圍內(nèi) ( 表 4 )。SpectraMax iD5 讀板機(jī)的信噪比略有提高，但兩種讀板機(jī)的信噪比均高于可接受的限值，CV 值 低 于 6%。SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5讀板機(jī)都為 cAMP Gs HiRange 檢測提供了高靈敏度和寬的動態(tài)范圍。

結(jié)論
SpectraMax i3x 和 SpectraMax iD5 讀板機(jī)可配備 HTRF 認(rèn)證的檢測卡盒 (i3x) 或 HTRF 認(rèn)證的模塊和濾片 (iD5)，以滿足 HTRF檢測所要求的苛刻參數(shù)。 兩種讀板機(jī)都證明了他們進(jìn)行 cAMP Gs HiRange 檢測的能力，結(jié)果完全在 Cisbio 要求的范圍內(nèi)。 數(shù)據(jù)采集和分析可以通過使用帶有預(yù)設(shè) HTRF 方法的 SoftMax Pro 軟件來進(jìn)行簡化。