聚山梨酯是由脂肪酸、山梨坦和環(huán)氧乙烷經(jīng)酯化、聚合而成，最常見的是聚山梨酯 20 和聚山梨酯 80（如圖 1）。聚山梨酯具有較好的生物相容性和低毒性，常在藥物制劑中作增溶劑和乳化劑。近年來，隨著制藥和生物制藥的快速發(fā)展，輔料對藥品安全性的影響日益受到重視，聚山梨酯具有一定的生物和藥理活性，出于用藥安全的考慮，會嚴格控制其在藥物制劑中的含量^[1]。

圖 1. 聚山梨酯 20（R=月桂酸酰基）和聚山梨酯 80（R=油酸?；┑慕Y(jié)構(gòu)式

最 新 2025 版藥典四部通則 3203《聚山梨酯 80 測定法》在原來比色法的基礎(chǔ)上增加了第二法熒光膠束法。原有比色法用到銨鈷硫氰酸鹽和二氯甲烷，具有一定的毒性，環(huán)境不友好，且需要復雜的樣品前期準備和處理，而新增的第二法熒光膠束法（HPLC-FLD）采用液相色譜系統(tǒng)內(nèi)衍生反應(yīng)，無需樣品前處理，無需色譜柱分離，整個檢測過程在 2 分鐘之內(nèi)完成，簡單高效，非常適合生物制品及其他藥物制劑中聚山梨酯含量的準確測定。

通則 3203《聚山梨酯 80 測定法》

第二法熒光膠束法

熒光膠束法基于一種疏水熒光染料 N- 苯基 -1- 萘胺（NPN）可與聚山梨酯膠束的非極性疏水性內(nèi)核結(jié)合，這種聚山梨酯膠束 -NPN 復合物的熒光強度與聚山梨酯膠束濃度呈正相關(guān)，因此可以對聚山梨酯進行定量測定。

參考 25 版藥典的方法，我們設(shè)置了如下的 HPLC-FLD 的液相分析方法：

在此條件下，聚山梨酯 80 在 2 min 之內(nèi)出峰，峰形較好（圖 2），且峰面積穩(wěn)定（如圖 3），而且在高濃度進樣后，系統(tǒng)沒有任何殘留影響。

圖 2. 聚山梨酯 80 的色譜圖

圖 3. 重復進樣 10 針聚山梨酯的色譜圖

同時我們進不同濃度的聚山梨酯 80 的對照品溶液，在 0.3 – 1.1 mg/ml 濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性好（圖 4）。

圖 4.  聚山梨酯標準曲線，線性范圍 0.3-1.1 mg/ml，R2=0.9998

對實際單抗制劑中聚山梨酯 80 的含量進行了準確測定，我們看到實際制劑樣品的峰面積的重復性數(shù)據(jù)特別好。雖然是在衍生管中進行快速的衍生反應(yīng)，但是衍生的效果穩(wěn)定且可靠，未受到制劑中高濃度抗體的影響?？紤]到有些實驗室環(huán)境溫度變化較大的情況下，可以在衍生管前后加上預加熱器，使衍生過程更穩(wěn)定。

表 1. 三個單抗供試品中聚山梨酯 80 峰面積重復性數(shù)據(jù)

在 HPLC-FLD 方法建立之初，中檢院俞小娟等老師對于 HPLC-FLD 法測定聚山梨酯 80 含量的方法學進行了聯(lián)合驗證^[2]，參考文獻的結(jié)果，大家可以在安捷倫各種型號的液相上放心使用該方法對聚山梨酯 80 或 20 進行準確檢測分析。

最 后，在看似簡單的 HPLC-FLD 分析過程中，有幾個實驗細節(jié)和小伙伴一起分享：

流動相臨用現(xiàn)配，避光保存；對照品溶液臨用現(xiàn)配；

系統(tǒng)平衡：需用高濃度聚山梨酯 80 質(zhì)控標準品（1 mg/ml）進樣至少 20 針平衡系統(tǒng)；

標準品來源：需用與添加原料同批次同廠家的聚山梨酯 80 作為標準品；

高濃度蛋白干擾：當?shù)鞍诐舛容^高（>20mg/ml）時，出現(xiàn)回收率超限的情況，建議前處理去除蛋白或者樣品稀釋。

結(jié)語

安捷倫提供生物制藥輔料的液相分析解決方案文集^[3]，內(nèi)容非常豐富。既對現(xiàn)有聚山梨酯的分析方案進行了拓展，包括采用 HPLC-ELSD 的方法對不同蛋白藥物制劑中的聚山梨酯 80 或者 20 進行準確的含量分析，同時收錄了更多的目前生物制藥行業(yè)制劑中用到的輔料，包括泊洛沙姆 P188，糖類和氨基酸類的分析方法，以及在細胞和基因治 療、核酸藥物和疫苗中的遞送載體和佐劑的分析方案。

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參考文獻：

^[1] 徐明明，程菁，吳利紅等.HPLC-熒光法測定單抗藥物中聚山梨酯的含量[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2019, 50(9):1047-1051 DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2019.09.016

^[2] 俞小娟，于傳飛，張榮建等.HPLC-FMA法測定單抗藥物中聚山梨酯80含量的方法學聯(lián)合驗證[J]. 藥學學報,2021,56(8): 2276-2281 DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0151

^[3] 安捷倫生物制藥輔料、載體及生產(chǎn)工藝殘留分析解決方案（第二版）,安捷倫科技公司應(yīng)用簡報，出版號：5994-4672ZHCN, 2022

標簽：安捷倫