簡介
病毒感染哺乳動物細胞通常會降低細胞活力，并對細胞造成明顯的影響，如形狀或大小的改變，或與鄰近細胞融合。這些變化被稱為細胞病變效應 (CPE)，可以通過光學顯微鏡或成像系統對細胞病變效應進行評估，或者使用更多的定量檢測手段對其進行測定。
Promega 公司的 Viral ToxGlo 檢測試劑盒可以檢測活細胞中存在的 ATP，并提供一種簡單的發(fā)光檢測方法來定量細胞
活力。由于病毒誘導的 CPE 會耗盡細胞中的 ATP，導致發(fā)光信號的減少，因此可以定量檢測宿主細胞中病毒誘導的 CPE。使 用簡單的混合 讀取工作流程，即可輕松地在 SpectraMaxiD5 多功能微孔板讀板機上檢測到試驗結果，并使用 SoftMaxPro 軟件進行分析 ( 圖 1 )。
這里，我們展示了如何使用 Viral ToxGlo 檢測試劑盒來測定病毒感染的哺乳動物細胞中的病毒感染力和半數組織培養(yǎng)感
染劑量 (TCID50)，以 及如何測量化合 物的抗病毒效力。本研究采用了之前描述的兩種病毒感染模型 : 甲型 H1N1 流感病。

優(yōu)勢
? 簡單的混合和讀取方法，添加試劑后僅需 10 分鐘即可獲得結果
? 適用于篩選的穩(wěn)定、靈敏的發(fā)光讀數
? 使用 SoftMax Pro 軟件自動生成數據和分析結果

材料

? Viral ToxGlo 檢測試劑盒 (Promega cat. #G8942)
? MDCK (NBL-2) 細胞系 (ATCC cat. #CCL-34)
? MRC-5 細胞系 (ATCC cat. #CCL-171)
? 生 長 培 養(yǎng) 基 ( 用 于 MDCK 和 MRC-5) : MEM (Corning cat.#10-010-CV) + 10% 胎牛血清 (FBS, Avantor Seradigm cat.#1500-500) + 青霉素 / 鏈霉素 (Thermo Fisher cat. #15070-063)
? 甲型流感病毒 (H1N1), (ATCC cat. #VR-95PQ)
? 人類冠狀病毒 229E (ATCC cat. #VR-740)
? 利巴韋林 (Sigma cat. #R-9644)
? 瑞德西韋 (MedChemExpress cat. #HY-104077)
? 96 孔白色、組織培養(yǎng)處理過的透明底微孔板 (Corning cat.#3610)
? Nunc 白色密封膠帶 (ThermoFisher cat. #236272)
? SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices)

方法
TCID50 測定
病毒感染力和組織培養(yǎng)感染劑量 (TCID) 的測定可以通過制備病毒原液的系列稀釋液，并將這些稀釋液添加到目標細胞中
暴露特定的時間來確定。在暴露結束時，使 用 Viral ToxGlo可以測定細胞活力的指標 ATP。TCID50 或 50% 細胞病變效應(CPE) 指能引起細胞活力降低 50% 所需的病毒稀釋度 ( 病毒量 )。該值被用于后續(xù)對抗病duyao物效力的研究。
將細胞以 10,000 個細胞 / 孔的比例接種在底部透明的 96 孔白色微孔板中。細胞在 37℃ 和 5% CO2 條件下附著并過夜生長。在培養(yǎng)基中對病毒原液進行 1:1000(H1N1) 或 1:5(HCoV-229E) 稀釋。在細胞板中進行半對數 ( 3.16 倍 ) 系列稀釋，將46 μL 初始病毒稀釋液添加到第 1 列的孔中 ( 初始體積為 100μL/ 孔 )。然后將 46 μL 從第 1 列轉移到第 2列，依此類推到第 10 列。從第 10 列的孔中取出 46 μL，使所有實驗孔的體積保持在 100 μL/ 孔。包括無病毒和無細胞對照孔。細胞與病毒在 37℃ 和 5% CO2 條件下孵育 3 天 (MDCK/H1N1) 或 6 天(MRC-5/HCov-229E)。

使用 Viral ToxGlo 試劑盒測定細胞病變效應。病毒處理 3 天或 6 天結束時，在檢測孔中加入 ATP 檢測試劑，將微孔板在室溫孵育 10 分鐘使細胞裂解。讀數前，將 Nunc 白色密封膠帶放置在每個透明底微孔板的底部，以Z大限度地提高發(fā)光信號。設置如表 1 所示，在 SpectraMax iD5 微孔板讀板機上讀取數據。

表 1 使 用 SpectraMax iD5 微 孔 板 讀 板 機 進 行 Viral ToxGlo 檢測的參數設置。 在 SoftMax Pro 軟件的板部分中進行特定設置。通過選擇“ 更多設置 ”下“ 顯示預讀優(yōu)化選項 ”(‘Show Pre-ReadOptimization Options’) 優(yōu)化讀取高度，并按照讀取開始后出現的說明進行操作。

使 用 SoftMax Pro 軟件中的 4 參 數曲線擬合將結果繪 制為RLU 與病毒稀釋因子的曲線，并從這些曲線中獲得每種病毒在其各自細胞系上的 TCID50 值 ( 圖 2 )。將 H1N1 病毒原液稀釋 999000 倍后，MDCK 活力降低了 50%。而將 HCoV-229E病毒原液稀釋 43 倍后，MRC-5 細胞的活力也發(fā)生了類似的降低。

復方抗病毒效力的測定
為了評估化合物利巴韋林和瑞德西韋在降低病毒處理細胞的細胞病變效應方面的有效性，將 MDCK 或 MRC-5 細胞以每
孔 10,000 個細胞的數量接種在 50 μL 培養(yǎng)基中，并置于底部透明的 96 孔白色微孔板中。包括只含有培養(yǎng)基的無細胞對照孔。細胞在 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中附著和過夜生長。在 MDCK 細胞中加入 1000 μM ~ 0.02 μM 的 1:3 連續(xù)稀釋的利巴韋林 25 μL。在 MRC-5 cells 細胞中加入 17 μM ~ 0.003μM 的 1:3 連續(xù)稀釋的瑞德西韋 25 μL。將導致細胞病變效果超過 TCID50 的Z佳細胞病變效應的原病毒稀釋液 (H1N1 為1:1000,HCov-229E 為 1:5)， 分 別 加 入 MDCK 或 MRC-5 細胞，體積為每孔 25 μL。為了確定化合物的脫靶細胞毒性，將利巴韋林或瑞德西韋加入到沒有病毒的細胞中，使用上述相同的稀釋倍數。處理過的細胞板在 37℃ 和 5% CO2 條件下孵育3 天 (MDCK) 或 6 天 (MRC-5)。
細胞與病毒和化合物孵育后，將 Viral ToxGlo ATP 檢測試劑加入檢測孔中，并將微孔板在室溫下孵育 10 分鐘，使細胞裂解。在 SpectraMax iD5 微孔板讀板機上讀取發(fā)光信號之前，在透明底微孔板底部放置 Nunc 白色密封膠帶 ( 設置，見表 1 )。使用 SoftMax Pro 軟件中的 4 參數曲線擬合將結果繪制為RLU 與化合物濃度的曲線，并從曲線中獲得每種化合物的EC50 值。利巴韋林可以部分挽救暴露于 H1N1 病毒的 MDCK細胞的活力，EC50 為 89 μM ( 圖 3A )。然而，當使用濃度大于100 μ M 的利巴韋林處理沒有病毒的細胞時，可以觀察到毒性作用。暴露于 HCoV-229E 的 MRC-5 細胞經過瑞德西韋處理后，細胞活力幾乎完全恢復，EC50 值為 215 nM ( 圖 3B )。瑞德西韋的脫靶效應很小，僅在 16 μM 以上時可見。

總結
與耗時的顯微鏡下評估病毒感染對細胞活力的影響相比，Viral
ToxGlo 檢測提供了一種簡單的混合 - 讀取模式。將試劑加入

毒 1 感 染 Madin-Darby 犬 腎 (MDCK) 細 胞， 人 冠 狀 病 毒 株
229E(HCoV-229E)2 感染 MRC-5 人肺成纖維細胞。將兩種具
有抗病毒作用的化合物利巴韋林 3 和瑞德西韋 4 應用于暴露于
病毒的細胞，并測定其抗病毒效力。