近年來，隨著醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和公眾對藥品安全認(rèn)知水平的不斷提升，加強(qiáng)對中藥外源性有害物質(zhì)的控制，建立有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)已成為滿足藥品監(jiān)管需求、保障公眾用藥安全的重要手段。中藥材大部分來源于植物和動物，在種植（養(yǎng)殖）過程中不可避免地會發(fā)生病蟲草害，需要使用農(nóng)藥進(jìn)行FZ；而使用農(nóng)藥不意味著濫用農(nóng)藥，國家對于高毒、高殘留、高安全風(fēng)險的化學(xué)農(nóng)藥出臺了禁用名單，需要首先加以監(jiān)控。

在參考了我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部自2002年至今發(fā)布過的化學(xué)農(nóng)藥禁限用公告后，《ZG藥典》2020年版經(jīng)剔除殺鼠劑、重金屬類農(nóng)藥、熏蒸劑、多異構(gòu)體、難以獲得對照品及難以采用常規(guī)氣質(zhì)、液質(zhì)測定的農(nóng)藥品種后，總計(jì) 33 種農(nóng)藥 55 個化學(xué)單體作為禁用農(nóng)藥檢測品種的檢測指標(biāo)。

本文參考2020版《ZG藥典》2341 通則中的第五法使用LabTech SPE 1000全自動固相萃取系統(tǒng)對常用根莖類藥材甘草中的農(nóng)藥進(jìn)行固相萃取，分別采用GC-MS、LC-MS檢測，建立了一套中藥農(nóng)殘的處理檢測方法，其中GC-MS組分別采用GCB/NH2柱凈化與HLB柱凈化樣品，兩種方法的回收率及平行性良好，加標(biāo)回收率分別為71.1%~101.2%和73.3%~106.7%，重復(fù)性RSD分別為1.2%~8.6%和1.3%~9.0%，LC-MS組采用HLB柱凈化樣品，加標(biāo)回收率為74.8%~113.4%，重復(fù)性RSD為2.3%~9.8%，均滿足藥典要求，適合2341第五法通則所規(guī)定中藥農(nóng)殘檢測。

1 儀器設(shè)備及試劑

1.1儀器設(shè)備

SPE 1000全自動固相萃取系統(tǒng)（萊伯泰科公司）；7890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫公司）；SCIEX Exion LC?液相系統(tǒng)+ Triple Quad? 4500質(zhì)譜系統(tǒng)（SCIEXZG公司）；MultiVap-10全自動高通量平行濃縮儀（萊伯泰科公司）；EV400VAC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（萊伯泰科公司）。

1.2 試劑及耗材

乙腈（色譜級）；甲苯（農(nóng)殘級）；乙腈-甲苯混合溶液（3∶1），現(xiàn)用現(xiàn)配；氯化鈉（分析純）；蒸餾水；HLB固相萃取住（200mg，6mL，萊伯泰科）；GCB/NH2固相萃取柱（500mg/500mg，6mL，萊伯泰科）33種農(nóng)殘混標(biāo)工作液：5μg/L，溶劑為乙腈，購自壇墨質(zhì)檢；磷酸三苯酯內(nèi)標(biāo)工作液：0.1mg/L，溶劑為乙腈，購自壇墨質(zhì)檢；30種農(nóng)殘混標(biāo)工作液：5μg/L，溶劑為乙腈，購自壇墨質(zhì)檢。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

稱取甘草粉末（過3號篩）5g，加氯化鈉1g，搖散后加入乙腈50mL，勻漿處理2min（每分鐘不低于12000轉(zhuǎn)），離心5min（每分鐘4000轉(zhuǎn)），取上清液，沉淀再加入50mL乙腈勻漿，離心，合并兩次上清液，旋蒸濃縮至3~5mL后，用乙腈定容至10mL。

2.2 GCB/NH2柱固相萃取法

將2.1制得的樣品各取2mL放入SPE 1000全自動固相萃取系統(tǒng)，按照圖1所示的方法進(jìn)行樣品的固相萃取凈化步驟。收集洗脫液，旋蒸濃縮，用乙腈轉(zhuǎn)移并定容至2mL。

圖1 GCB/NH2柱固相萃取流程

2.3 HLB柱固相萃取法

將2.1樣品各取3mL放入SPE1000全自動固相萃取系統(tǒng)，按照圖2所示的方法進(jìn)行樣品的固相萃取凈化步驟，收集凈化液。

圖2 HLB柱固相萃取流程

2.4 基質(zhì)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：分別按照2.2、2.3制備空白基質(zhì)溶液，各取1mL（每種方法所得樣品平行6份）至MultiVap-10全自動高通量平行濃縮儀上，40℃濃縮至約0.6mL，分別加入10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL混標(biāo)工作液，加乙腈定容至1mL，混勻。

按2.1方法準(zhǔn)備樣品，進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，5g樣品加標(biāo)1μg，然后分別按照2.2、2.3方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時進(jìn)行6個平行樣品，用來測定加標(biāo)回收率及平行性。

取處理好的樣品溶液（或基質(zhì)混標(biāo)溶液）1mL，GC-MS法精密加入內(nèi)標(biāo)0.3mL，LC-MS法精密加入水0.3mL，混勻待測。

2.5 GC-MS分析條件

2.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：Agilent DB-5ms毛細(xì)管柱：30 m*250 μm*0.25μm；

進(jìn)樣口溫度：270℃；

柱溫程序：初始溫度100℃，以5℃/min升至180℃，保持5min，然后以5℃/min升至220℃保持6min，再以10℃/min升至280℃，保持5min。

進(jìn)樣量：1 μL；

進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；

流速：1.0mL/min；

2.5.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度：280℃；

輔助加熱溫度：290℃；

溶劑延遲：3min；

掃描方式：全掃描（SCAN）方式用于定性/選擇離子掃描模式（SIM）用于定量。

2.6  LC-MS分析條件

2.6.1 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack Velox C18（2.7μm，2.1*100mm）；

流動相：A: 0.1％甲酸溶液（含5 mmol/L 乙酸銨）；B:乙腈-0.1％甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸銨）（95:5）；

流速：0.4 mL/ min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2 μL；

洗脫梯度：0~1min，30%B；7min~8min，100%B；8.1~10min，30%B。

2.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源，正離子模式；

離子源參數(shù)：

IS電壓：5500V 氣簾氣CUR:30 psi；

霧化氣GS1:55 psi 輔助氣GS2:55 psi；

源溫度TEM:550℃碰撞氣CAD:Medium。

3 結(jié)果和討論

3.1 各樣品色譜圖

圖3 標(biāo)準(zhǔn)工作液GC-MS總離子流色譜

圖4 空白樣品GC-MS總離子流色譜圖

圖5 基質(zhì)加標(biāo)GC-MS總離子流色譜圖

圖6 標(biāo)準(zhǔn)工作液GC-MS選擇離子流色譜圖

圖7 基質(zhì)加標(biāo)GC-MS選擇離子流色譜圖

圖8 標(biāo)準(zhǔn)工作液LC-MS總離子流色譜圖

圖9 基質(zhì)加標(biāo)LC-MS總離子流色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按2.4中的配制的基質(zhì)混標(biāo)溶液（0.05μg/mL~1μg/mL）計(jì)算得出各組分（以相對峰面積和相對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線) 的線性方程、相關(guān)系數(shù)，見表1、2、3。

表1  33種農(nóng)殘GC-MS法線性方程（GCB/NH2柱固相萃取法）

表2 33種農(nóng)殘GC-MS法線性方程（HLB柱固相萃取法）

表3  30種農(nóng)殘LC-MS法線性方程（HLB柱固相萃取法）

3.3 加標(biāo)回收率

加標(biāo)樣品經(jīng)固相萃取凈化、洗脫、濃縮后，分別進(jìn)行GC-MS、LC-MS分析，定量，計(jì)算得到的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表4、5、6所示。

表4 33種農(nóng)殘GC-MS法加標(biāo)回收率（GCB/NH2柱固相萃取法）

表5  33種農(nóng)殘GC-MS法加標(biāo)回收率（HLB柱固相萃取法）

表6  30種農(nóng)殘LC-MS法加標(biāo)回收率（HLB柱固相萃取法）

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

由表4、5、6可知，2020版《ZG藥典》2341第五法GC-MS組中GCB/NH2柱固相萃取和HLB柱固相萃取的加標(biāo)回收率分別為71.1%~101.2%和73.3%~106.7%，重復(fù)性RSD分別為1.2%~8.6%和1.3%~9.0%，LC-MS組HLB柱固相萃取的加標(biāo)回收率為74.8%~113.4%，重復(fù)性RSD為2.3%~9.8%，均滿足藥典要求。

綜上所述，萊伯泰科SPE1000全自動固相萃取系統(tǒng)、EV400VAC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及MultiVap-10全自動高通量平行濃縮儀能夠gao效、穩(wěn)定地達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求，適用于2020版《ZG藥典》2341第五法中規(guī)定的中藥農(nóng)殘測定，適用于中藥甘草樣品的前處理實(shí)驗(yàn)。

5 參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國藥典2020年版. 四部［S］.2020: 30ChP 2020. VolⅣ［S］. 2020: 30.

[2] 申明睿,翟為民,何軼,石上梅,楊昭鵬,蘭奮.《中華人民共和國藥典》2020年版中藥禁用農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的研究思路[J].藥物分析雜志,2020,40(11):2075-2081.