氯丙醇酯污染是近年來國際上出現(xiàn)的食品安全熱點問題之一，氯丙醇酯是氯丙醇類化合物與脂肪酸的酯化產(chǎn)物，食品中檢出量較高的是3-氯丙醇酯。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在谷物、咖啡、魚、肉制品、馬鈴薯、堅果和以植物油為原料的熱加工油脂食品中都有3-氯丙醇酯檢出，尤其在精煉植物油等食品中檢出3-氯丙醇酯的報道逐漸增加?？s水甘油酯是脂肪酸與縮水甘油的酯化產(chǎn)物，它與氯丙醇酯是一對孿生兄弟，形成機理相似。在油脂精煉過程中，縮水甘油酯通常會伴隨3-氯丙醇酯一起形成，3-氯丙醇酯含量高，縮水甘油酯含量也高。3-MCPD可損害腎臟和生殖系統(tǒng)等，國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將游離態(tài)3-MCPD列入2B類致癌物清單，將游離態(tài)縮水甘油列入2A類致癌物清單。

安譜實驗和南京海關(guān)動植物與食品檢測中心共同合作，參照國際標準“ISO 18363-3:2017”和國標征求意見稿“GB 5009.191-×××× 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定”第二篇第二法，并對方法進行優(yōu)化，使用緩慢酸水解方法進行酯鍵斷裂，苯基硼酸進行衍生，氣相色譜-質(zhì)譜進行檢測，內(nèi)標法進行定量，對不同植物油中的氯丙醇酯和縮水甘油酯的含量進行了檢測，方法回收率高，精密度好。

目前安譜實驗與南京海關(guān)動植物與食品檢測中心已建立戰(zhàn)略合作伙伴關(guān)系。近年來，雙方已在科研項目、技術(shù)服務、培訓合作、能力驗證等多個層面展開合作。南京海關(guān)動植物與食品檢測中心是隸屬于南京海關(guān)的獨立法人第三方事業(yè)單位，主要承擔進出境食品、化妝品、動植物及其產(chǎn)品的法定檢驗、檢測、檢疫工作。在食品領(lǐng)域檢測能力卓 越，獲得國家CNAS認可、CMA資質(zhì)認定和CNAS能力驗證計劃提供者等國內(nèi)外權(quán)威資質(zhì)。目前南京海關(guān)動植物與食品檢測中心已完全具備食品中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測能力，并積累了多種基質(zhì)的檢測經(jīng)驗。

一、原理

在酸性溴化鹽溶液中，3-氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為3-氯丙二醇（3-MCPD）單酯、2-氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為2-氯丙二醇（2-MCPD）單酯、縮水甘油酯轉(zhuǎn)化為3-溴丙二醇（3-MBPD）單酯。隨后，在酸性甲醇溶液中3-MCPD酯、2-MCPD酯和3-MBPD酯轉(zhuǎn)化為游離態(tài)（非酯化形式），通過萃取去除樣品中反應生成的脂肪酸甲酯。使用苯基硼酸對3-MCPD、2-MCPD及3-MBPD進行衍生，氣相色譜-質(zhì)譜檢測，內(nèi)標法定量。

二、標準品

實驗用到的標準品信息見下表：

表1 標準品信息

01

標準品溶液配置

混合標準儲備液（3-MCPD:54.7 μg/mL，2-MCPD:49.7 μg/mL，Gly:57.8 μg/mL）：準確稱取5.81 mg 3-MCPD-PP、5.79 mg 2-MCPD-SS和4.88 mg GLy-P于20 mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混勻。

混合標準工作溶液I（3-MCPD:19.1 μg/mL，2-MCPD:17.4 μg/mL，Gly:20.2 μg/mL）：準確移取3.5mL混合標準儲備溶液至10mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混勻。

混合標準工作溶液II（3-MCPD:1.91 μg/mL，2-MCPD:1.74 μg/mL，Gly:2.02 μg/mL）：準確移取350 μL混合標準儲備溶液至10mL容量瓶中，甲苯溶解，定容至刻度，混勻。

內(nèi)標混合標準工作溶液（D5-3-MCPD:5.0 μg/mL，D5-2-MCPD:5.0 μg/mL，D5-Gly:5.0 μg/mL）：用移液管分別準確移取0.5 mL D5-3-MCPD-PP標準溶液（100 μg/mL）、1.0 mL D5-2-MCPD-SS標準溶液（50 μg/mL）和0.5 mL D5-GLy-P標準溶液（100 μg/mL）到10 mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度線。

標品配制注意事項：

1.標準溶液濃度需根據(jù)標品實際稱樣質(zhì)量、標品純度以及目標物折算系數(shù)進行具體計算。

2.可選擇安譜璀世溶液型標品，進行稀釋配制，操作更加方便。

02

標準曲線配制

如下表所示，加入混合內(nèi)標工作溶液和混合外標工作溶液，按照“樣品前處理步驟”進行操作，上機檢測得到標準曲線。

表2 標準曲線的配制

三、前處理步驟

試劑配置：

溴化鈉酸性溶液（溴化鈉3 mg/mL，硫酸5%，v/v）：將1 g溴化鈉溶解于10 mL水中；取該溴化鈉溶液180 μL，加入0.3 mL硫酸、5.5 mL水，劇烈震蕩，充分混勻。建議每天新鮮配制。

碳酸氫鈉溶液（0.6 %，m/v）：稱取0.6 g碳酸氫鈉于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。超聲使其全部溶解。

硫酸-甲醇溶液（1.8 %，v/v ）：吸取1.8 mL硫酸于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。建議每天新鮮配制。

碳酸氫鈉溶液（飽和）：稱取9.6 g碳酸氫鈉于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，超聲震蕩，取上清液使用。

硫酸鈉溶液（20 %，m/v）：稱取20 g硫酸鈉于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。超聲使其全部溶解。

苯基硼酸溶液：稱取3 g苯基硼酸，加入12 mL丙酮/水混合溶液（19/1，v/v），劇烈震蕩混勻。

試樣提?。?/b>

準確稱取0.1~0.2 g（精確至0.0001 g）食用油/油脂樣品于螺口玻璃試管中，依次加入60 μL混合內(nèi)標工作液，2 mL四氫呋喃，渦旋15 s（或直至樣品完全溶解）。

鹵化反應：

向試樣提取液中加入30 μL溴化鈉酸性溶液，蓋緊蓋子，渦旋震蕩。50 ℃反應15 min，加入3 mL 0.6%碳酸氫鈉溶液終止反應。加入2 mL正己烷，渦旋震蕩15 s，靜置分層后，轉(zhuǎn)移上層液至另一螺口玻璃試管中，再用2 mL正己烷重復提取1次，合并正己烷相，氮吹至近干，用1 mL四氫呋喃溶解殘渣。

試樣凈化：

加入1.8 mL硫酸-甲醇溶液，渦旋震蕩 15 s。蓋緊瓶蓋，40℃反應16小時，加入0.5 mL碳酸氫鈉飽和溶液終止反應。渦旋15 s，氮吹除去試樣混合液中的有機溶劑（剩余液體約1 mL左右）。向剩余液中依次加入2 mL 20%硫酸鈉溶液、2 mL正己烷，渦旋震蕩15 s，靜置分層后，棄去上層正己烷相，再用2 mL正己烷萃取一次，棄去上層正己烷相，下層的水相溶液待進行衍生化反應。

衍生化反應：

向凈化液中加入200 μL苯基硼酸溶液，渦旋15 s后，于室溫下超聲5 min。取出后，加入1.0 mL正己烷，渦旋15 s，靜置分層后，移取上層含有衍生物的有機相，加入0.5g無水硫酸鈉，渦旋混勻10 s，提取液過0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器注入進樣小瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。

前處理注意事項：

1.若樣品常溫下為固體，稱樣后可在 80℃水浴，250 r/min震蕩攪拌2 min，直至所有脂肪融化溶解；

2.前處理過程中盡量避免試樣塑料耗材，可使用玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動進樣針等耗材，建議進行方法空白實驗監(jiān)控過程本底情況；

3.建議使用疏水性PTFE針式濾器進行過濾。

四、儀器條件

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

色譜柱：毛細管氣相色譜柱CD-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

進樣量：1 μL

進樣口溫度：320℃，不分流進樣，不分流時間1 min

載氣：氦氣，隔墊吹掃流量：5.0 mL/min，分流吹掃流量：20 mL/min

色譜柱流速：1.0 mL/min

升溫程序：初始溫度70 ℃保持1 min，10 ℃/min升至160 ℃，5 ℃/min升至180 ℃，以25 ℃/min升至325 ℃保持5 min。

傳輸線溫度：320℃    離子源溫度：280℃

離子化能量：70 eV     溶劑延遲時間：8 min

掃描模式：選擇離子監(jiān)測SIM模式，離子對信息見表3。

表3 目標物離子對信息

儀器維護注意事項：

1.該實驗方法對儀器存在一定的污染情況，儀器受到嚴重污染后，可能導致目標物響應降低、分離度變差等情況，需注意儀器的清洗維護，包括進樣針的清洗，離子源的清洗，色譜柱的老化等；

2.可采用加裝2m預柱、使用反沖功能、程序升溫進樣口功能等操作，降低儀器的污染程度。

五、實驗譜圖

圖1 氯丙醇酯和縮水甘油酯標準溶液譜圖

（標線第5點 STD-5）

圖2 大豆油樣品空白和樣品加標的TIC譜圖

（下圖為樣品空白，上圖為樣品加標2mg/kg）

六、標準品

1、標準曲線數(shù)據(jù)

3-MCPD、2-MCPD、Gly的標準曲線和線性相關(guān)系數(shù)見下表。

表4 3-MCPD、2-MCPD、3-MBPD標準曲線

注：1、本實驗3-氯丙醇酯使用D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量內(nèi)標；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量內(nèi)標；縮水甘油酯使用D5-縮水甘油棕櫚酸酯作為定量內(nèi)標。

02

加標回收率數(shù)據(jù)

橄欖油和大豆油樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量和加標樣品（加標水平為2.0mg/kg）回收率數(shù)據(jù)見下表。

表5  橄欖油和大豆油基質(zhì)的加標回收率數(shù)據(jù)

（加標水平2.0mg/kg  n=3）

注：1、N.D表示未檢出；2、酸水解方法中3-氯-1, 2-丙二醇酯不會轉(zhuǎn)換成縮水甘油（Gly），因此不影響縮水甘油酯含量的計算。

03

棕櫚油樣品檢測數(shù)據(jù)

分別使用快速堿水解方法（ISO 18363-4）和緩慢酸水解方法（ISO 18363-3）兩種前處理方法檢測棕櫚油樣品，樣品含量檢測數(shù)據(jù)見下表。

表6 不同方法檢測棕櫚油基質(zhì)中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的含量對比

注：表中數(shù)據(jù)均進行了回收率折算。

七、實驗結(jié)論

使用安譜實驗標準品和相關(guān)耗材，參照國際標準“ISO 18363-3:2017 Animal and vegetable fats and oils - Determination of fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS - Part 3: Method using acid transesterification and measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol”和國標征求意見稿“GB 5009.191-×××× 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定 第二篇第二法”，使用緩慢酸水解的方法對植物油樣品的3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油酯進行檢測，加標回收率在90%-115%之間，RSD均小于10%，該方法操作簡便穩(wěn)定。使用兩種不同前處理方法檢測棕櫚油樣品，緩慢酸水解方法的檢測結(jié)果和快速堿水解方法的檢測結(jié)果無明顯差異，表明兩種前處理方法均能夠很好的滿足植物油基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測。

八、實驗中所用到的耗材