樣品水解

(1)稱(chēng)取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（2.1.3），加入蛋白水解試劑（2.2.9），旋緊蓋子，振蕩混勻，110 °C下反應(yīng)24 h。

(2)反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至100 mL蒸餾瓶中，75℃下減壓蒸餾至近干。

(3)用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液（2.2.10）分三次溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移到20 mL玻璃具塞刻度試管（2.1.5），再用純水定容至20 mL，待衍生。

樣品衍生 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法

（1）樣品水解溶液衍生 量取200 μL樣品水解溶液，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（2.2.12）和100 μL衍生劑PITC溶液（2.2.11），混勻， ? ? ? ? ? ? 室溫反應(yīng)1h，加入400μL正己烷（2.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過(guò)濾器（2.1.7） ? ? ? ? ? ? 過(guò)濾，待分析。

（2） 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化 量取200 μL L-羥脯氨酸使用液*（2.2.16），置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（2.2.12）和100 μL衍生劑PITC溶液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? （2.2.11），混勻，室溫反應(yīng)1h，加入正己烷400 μL（2.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針 ? ? ? ? ? ? 式過(guò)濾器（2.1.7）過(guò)濾，待分析。?

*根據(jù)實(shí)際情況，氨基酸使用液濃度可進(jìn)行調(diào)整，本方法中氨基酸使用液濃度僅供參考。 2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生方法

（1） 樣品溶液衍生 取0.5 mL樣品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度試管（2.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液（2.2.14）和0.5 mL衍生劑DNFB溶液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? （2.2.13），具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（2.2.17）定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過(guò)濾器 ? ? ? ? ?（2.1.7）過(guò)濾，待分析。

（2） 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生 取0.5 mL L-羥脯氨酸使用液（2.2.16）置于5 mL玻璃具塞刻度試管（2.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液（2.2.14）和0.5 mL衍生劑 ? ? ? ? ? DNFB溶液（2.2.13），具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（2.2.17）定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm ? ? ? ? ?針式過(guò)濾器（2.1.7）過(guò)濾，待分析。

異硫氰酸苯酯（PITC）衍生色譜條件

色譜柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm，5 μm（Cat.#：99751）

流動(dòng)相A: 0.05 mol/L乙酸鈉水溶液（冰乙酸調(diào)節(jié)pH值為6.50 ± 0.05）

流動(dòng)相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20（V : V : V）

流速: 1.0 mL/min 檢測(cè)波長(zhǎng): UV 254 nm 柱溫: 45 ℃

進(jìn)樣體積: 10 μL 梯度程序 T/min 0 39 40 45 46 60 A/% 95 52 0 0 95 95 2,4-二硝基氟苯（DNFB）

衍生色譜條件 色譜柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm，5 μm（Cat.#：99751）

流動(dòng)相A: 0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液

流動(dòng)相B: 甲醇 : 乙腈=10 : 90 （V : V）

流速: 1.0 mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng): UV 360 nm

柱溫: 35 ℃

進(jìn)樣體積: 10 μL 梯度程序 時(shí)間/min 0 39 44 44.01 65 流動(dòng)相A/% 86 60 30 86 86