簡介
污染物監(jiān)測是制藥和醫(yī)療器械行業(yè)生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 其中一種較常見的污染物—內(nèi)毒素，它可以引起發(fā)燒、炎癥、頭痛、 惡心， 甚至死亡。 內(nèi)毒素是在革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中被發(fā)現(xiàn)的， 目前可以利用敏感的、特異性的鱟試劑 ( LAL ) 法對其進(jìn)行檢測。
在內(nèi)毒素存在的情況下，LAL 通過酶介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的凝聚現(xiàn)象， 傳統(tǒng)方式是我們可利用其凝聚產(chǎn)生的渾濁度變化對其進(jìn)行定量檢測。Pyrochrome 檢測試劑是美國科德角公司(ACC) 推出的一款內(nèi)毒素定量檢測產(chǎn)品，其組成含有對硝基苯胺 (pNA) 的合成底物，由于顏色變化后可用于吸光度檢測， 凝集化酶是由內(nèi)毒素 ( 間接 ) 激活的酶裂解底物，釋放 pNA，其在 405 nm 處有很強的光吸收值，我們在微孔板讀板機上進(jìn)行檢測，OD值高低與樣品中的內(nèi)毒素濃度成正比。 對于企業(yè)來說使用儀器和軟件必須在相應(yīng)的合規(guī)環(huán)境來獲取和存儲數(shù)據(jù)，維護(hù)數(shù)據(jù)完整性是一項非常重要和迫切的
任務(wù)，符合 FDA 21 CFR Part11 法規(guī)要求環(huán)境， 如果使用多個軟件用于數(shù)據(jù)的收集、 分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸?shù)脑捒赡軙?br/>導(dǎo)致潛在錯誤， 并讓可追溯性變的復(fù)雜。 此外還額外產(chǎn)生應(yīng)用支持、 多個應(yīng)用程序上驗證和培訓(xùn)人員的費用等。

優(yōu)勢
? 用于生產(chǎn)過程中內(nèi)毒素污染檢測的靈敏、特異性方法
? 標(biāo)準(zhǔn)曲線中到達(dá)一定檢測值的時間，利用插值法計算樣品中內(nèi)毒素的濃度
? 完整的數(shù)據(jù)采集和分析解決方案

使用經(jīng)過驗證 Molecular Devices 的 VersaMax? 光吸收讀板機和 Pyrochrome 檢測試劑進(jìn)行相應(yīng)檢測，結(jié)合 SoftMax Pro GxP合規(guī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。SoftMax Pro 軟件內(nèi)置針對該內(nèi)毒素檢測試劑盒的檢測模板，無需設(shè)置，直接讀數(shù)后自動化獲得數(shù)據(jù)并判斷結(jié)果是否通過。此外，SoftMax Pro GxP 合規(guī)軟件符合GLP/GMP 指南要求，針對不同用戶之間對軟件進(jìn)行的設(shè)置、公式修改、數(shù)據(jù)生成、電子簽名文件生成都有明確分級管理的功能。
本篇應(yīng)用介紹了如何針對該試劑盒在VersaMax 光吸收酶標(biāo)儀上進(jìn)行參數(shù)設(shè)置、SoftMax Pro GxP 軟件上獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線并繪制曲線圖表過程。
材料
? VersaMax 微孔板讀板機(Molecular Devices cat. #VERSAMAX)
? SoftMax Pro GxP 軟件 (MolecularDevices cat. # SMP54-GXP-10UL)
? Pyrochrome 檢測試劑盒(ACC cat. #C1500)
? 內(nèi)毒素質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 (ACC cat. #E010)
? Pyroplate 96 孔板 (ACC cat. #CA961)

方法
首先打開 VersaMax 讀板機并在電腦端登陸 SoftMax Pro GxP 軟件，然后在微孔板中加入試劑。隨后在 SofMax Pro GxP 軟件的模板文件菜單中選擇“Pyrochrome Kinetic”檢測方法，可以在電腦上看見新的數(shù)據(jù)類型文件被創(chuàng)建。
檢測方法和試劑信息可隨時輸入軟件內(nèi)置的記事本中，當(dāng)然進(jìn)行相應(yīng)操作用戶必須具有輸入文本和修改公式的權(quán)限。
當(dāng)具有相應(yīng)的用戶權(quán)限時，則可以編輯試劑樣品真實的放置在微孔板區(qū)域及梯度稀釋關(guān)系，我們將其分配到微孔板任何區(qū)域并可以隨時進(jìn)行改。 除非用戶具有SoftMax Pro GxP 軟件的設(shè)置和計算功能權(quán)限，否則將無法進(jìn)行相應(yīng)操作。將儀器內(nèi)部溫度設(shè)置至 37 攝氏度。我們使用 3.2ml 溶解緩沖液對 Pyrochrome 試劑進(jìn)行充分溶解，均勻輕度混勻以避免產(chǎn)生大量泡面降低檢測靈敏度。
我們使用 LAL 試劑專用水對標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素溶液進(jìn)行一系列梯度稀釋，用于制作標(biāo)準(zhǔn)品曲線溶液的Z終的濃度是 50、5、0.5、0.05 和 0.005 EU/ml，每個濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備三個重復(fù)以 50 μl 體積加入值微孔板中，當(dāng)然要確保整個反應(yīng)體系中不存在內(nèi)毒素和葡聚糖污染物的干擾。
? 50 μl LAL 試劑專用水溶液以三個復(fù)孔的方式加入微孔板中作為陰性對照
? 50 μl 重懸 Pyrochrome 檢測試劑快速加入微孔板的每個孔中
注：或者每個標(biāo)準(zhǔn)品/質(zhì)控品 1:1 比率關(guān)系，100 μl 總體積：裂解液的比率我們將相應(yīng)的微孔板迅速放入微孔板讀板機中，然后點擊 SoftMax Pro GxP，界面正上方綠色的“Read”按鍵進(jìn)行檢測。軟件程序會執(zhí)行相應(yīng)設(shè)置。

? 在進(jìn)行檢測以前，程序步驟會要求儀器進(jìn)行適當(dāng)強度的自動混勻，確保液體混合均勻且不飛濺出孔外。
? 405 nm 處的吸光度值，我們每隔 10-15秒收集一次數(shù)據(jù)，持續(xù) 1 小時，并實時顯示max靈敏度，間隔時間和總檢測時間可以根據(jù)不同批次的試劑所推薦時間進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。
? 可以設(shè)置每個孔達(dá)到某一指定 OD 值的時間，軟件可以自動計算并顯示出到達(dá)相應(yīng)OD值的時間，這個模板內(nèi)置的是
達(dá)到 0.03 OD 值的時間點，當(dāng)然可以根據(jù)實際需求進(jìn)行更改。
? 使用log-log方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合數(shù)據(jù)，至少需要三個數(shù)據(jù)點。
注：在進(jìn)行自動計算和曲線擬合前必須對相應(yīng)孔進(jìn)行相應(yīng)定義。
? 斜率、y 軸截距和相關(guān)系數(shù)見圖例和總結(jié)結(jié)果的部分。
結(jié)果
獲得的結(jié)果說明 VersaMax 微孔板讀板機可用于 Pyrochrome 試劑進(jìn)行相應(yīng)檢測，將平均達(dá)到 OD 值時間 ( 秒 ) 的均值與已知濃度以 log-log 擬合方式作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。( 圖 1 )內(nèi)置于 SoftMax Pro GxP 軟件的檢測模板，可用于自動確定樣品的分析數(shù)值和判斷結(jié)果的有效性。
? 相關(guān)系數(shù) R^2 值至少高于 0.980
? 陽性質(zhì)控樣品應(yīng)在等效標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)品濃度的50-200% 之間
? 內(nèi)毒素濃度陰性質(zhì)控樣品 ( 由標(biāo)準(zhǔn)曲線外推法確定 )，應(yīng)大大低于Zlow標(biāo)準(zhǔn)濃度

結(jié)論
我們獲得一條線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)曲線的復(fù)孔之間的 CV 值很小，結(jié)果反映出其檢測靈敏度很高，發(fā)現(xiàn)可以使用 VersaMax和 Pyrochrome 試劑進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測和分析，并證明其檢測優(yōu)異性能。借助于顏色隨著時間的變化，達(dá)到某一個制定 OD值的時間，那么 SoftMax Pro GxP 軟件可通過標(biāo)準(zhǔn)品曲線自動計算出內(nèi)毒素濃度，可以限制在標(biāo)準(zhǔn)曲線的起始平均時間范圍內(nèi)。SoftMax Pro GxP 軟件對數(shù)據(jù)文件中的所有工作流程及結(jié)果進(jìn)行了相應(yīng)的審計追蹤。在檢查完結(jié)果之后，可以通過對文件進(jìn)行電子簽名來鎖定文件，防止發(fā)生進(jìn)一步的更改，而不管所分配的權(quán)限如何?？梢允褂枚鄠€簽名來指示各種角色，例如審閱人和審批人等。本文中通過 VersaMax 微孔板讀板機和Pyrochrome 試劑獲得高靈敏和特異性檢測結(jié)果。使用了 SoftMax Pro GxP 軟件的VersaMax 微孔板讀板機可進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，大大減低了在多個軟件之間進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸、分析、生成報告等所產(chǎn)生潛在風(fēng)險和成本。
SoftMax Pro GxP 軟件符合 GLP/GMP 法規(guī) ( 如 FDA 21 CFR Part 11 的電子記錄、審計追蹤 ) 的要求，通過控制授權(quán)用戶的權(quán)限和建立重要操作的可追溯性來維護(hù)數(shù)據(jù)的完整性。