簡(jiǎn)介
定量啤酒中谷蛋白
由于Z近乳糜瀉患病率呈上升趨勢(shì)，對(duì)于越來越多的需要避免谷蛋白攝入的人們來說，監(jiān)測(cè)食品和飲料中的谷蛋白水平變得尤為重要。FDA 指南中明確指出食品標(biāo)簽上標(biāo)明“gluten-free” 、“no gluten”、“free of gluten”或“without gluten”的，谷蛋白含量必須小于 20 ppm。這是目前檢測(cè)方法能夠接受的定量限。谷蛋白天然存在于小麥、黑麥、大麥和這類谷物中。在這些谷物中，它是存在于這些谷物中的丙氨酸和谷氨酸蛋白的混合物。在食品生產(chǎn)和食物消化工程中，完整的醇溶谷蛋白分解成小肽片段，這些小肽對(duì)乳糜瀉患者仍然是有危害的。這些小肽片段無法用三明治 ELISA 檢測(cè)，因?yàn)檫@種分析方法需要 2 個(gè) 抗原表位 。 然 而 ，RIDASCREEN 麥醇溶蛋白競(jìng)爭(zhēng) ELISA 可以檢測(cè)這些小肽片段，它是通過一個(gè)新的標(biāo)準(zhǔn)品，小麥，黑麥和大麥的水解產(chǎn)物來檢測(cè)的 ( 圖 1 )。這個(gè)試劑盒中的 R5 抗體用來識(shí)別來自小麥的醇溶蛋白和來自黑麥和大麥的醇溶谷蛋白這些可能有害的多肽片段 (Kahlenberg et al., 2005) 。
很多產(chǎn)品能夠檢測(cè)不同類型樣品中的谷蛋白含量，但是不是所有能夠定量檢測(cè)，不是所有都通過了認(rèn)證檢測(cè)。RIDASCREEN麥醇溶蛋白競(jìng)爭(zhēng) ELISA 試劑盒是 AACC 國際認(rèn)證 (38-55.01) 和 AOAC 官方認(rèn)證的分方法 ( 第一行動(dòng) OMA 2015.05 ) ，經(jīng)過國際上 18 個(gè)實(shí)驗(yàn)室用啤酒，淀粉糖漿和酵母評(píng)估。在第二國際協(xié)作研究中，美國釀酒化學(xué)家協(xié)會(huì) (ASBC) 選出 15 個(gè)實(shí)驗(yàn)室，通過 5 種不同啤酒對(duì) RIDASCREEN 麥醇溶蛋白競(jìng)爭(zhēng) ELISA 試劑盒進(jìn)行評(píng)估。這種 ELISA 方法現(xiàn)在是 ASBC 國際認(rèn)證的方法 (Beer-49) 。
本文我們利用 RIDASCREEN 麥醇溶蛋白競(jìng)爭(zhēng) ELISA 試劑盒檢測(cè)了 6 種市場(chǎng)上買到的啤酒中的麥醇溶蛋白水平。檢測(cè)的啤酒包括無谷蛋白，低谷蛋白，小麥啤酒和其他種類的啤酒。ELISA 通過 SpectraMax ABSPlus 微孔板讀板機(jī)讀板，數(shù)據(jù)結(jié)果通過SoftMax Pro 軟件分析。定量分析結(jié)果證實(shí)，無谷蛋白和低谷蛋白啤酒的谷蛋白含量低于 20 ppm。

優(yōu)勢(shì)
? 采用經(jīng)過認(rèn)證的方法定量檢測(cè)啤酒和其他食品中的谷蛋白含量
? MultiWash+ 微孔板洗板機(jī)自動(dòng)進(jìn)行 ELISA 洗板，節(jié)省時(shí)間
? 使用 SoftMax Pro 軟件快速獲得分析結(jié)果

材料
? RIDASCREEN 麥醇溶蛋白競(jìng)爭(zhēng)試劑盒(Art. No. R7021)
? 市面上買到的啤酒：
? 低谷蛋白
? 無谷蛋白
? 小麥啤酒
? 金色麥芽酒
? 美式波特
? 印度麥酒
? 40%冷水魚皮明膠 (ElectronMicroscopy Sciences cat. #25560)
? Multi-Wash+ 微孔板洗板機(jī)(Molecular Devices cat. #MultiWash+)
? SpectraMax ABS Plus 微孔板讀板機(jī)(Molecular Devices cat. #ABS Plus)
試劑制備
試劑盒中所有試劑都按照產(chǎn)品說明書制備。
? 緩沖液 ( 樣品稀釋液 ) 去離子水1：5 稀釋
? 洗滌緩沖液 37℃ 溫育去除結(jié)晶，去離子水 1：10 稀釋
? 抗體酶結(jié)合物混勻，去離子水1：11 稀釋?，F(xiàn)用現(xiàn)稀釋
? 底物和終止液即開即用
啤酒樣品制備
1 mL 啤酒和 9 mL 含有 10% 冷水魚皮明膠的 60% 乙醇混合于 15 mL 離心管中，渦旋混合均勻。2500 rpm 離心 10 分鐘。上清即可用于分析檢測(cè)，也可存儲(chǔ)在密閉容器中黑暗下置于室溫 4 周。上清用稀釋好的樣品稀釋液 1：50 稀釋后再分析檢測(cè)。
ELISA
取出 3 列復(fù)孔板條放置在微孔板條支架上，其余存放在有干燥劑的鋁箔小袋中。將 50 μL 麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 ( 0、10、30、90 和 270 ng/mL ) 或制備好的樣品加入復(fù)孔中。同時(shí)留有復(fù)孔 ( 沒加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品 )作為板空白。每孔中加入 50 μL 稀釋好的抗體酶結(jié)合物并輕搖板子混勻。板子室溫孵育 30 分鐘。然后，用 MultiWash+ 微孔板洗板機(jī) 250 μL 稀釋的洗滌緩沖液洗板3次。

每孔加入 100μL 底物，包括板空白。輕搖板混勻，黑暗下室溫放置 10 分鐘。每孔加入 100 μL 終止液，輕搖板混勻。10 分鐘后，用 SpectraMax ABS Plus 調(diào)用SoftMax Pro 軟件中預(yù)存的 ELISA 方法在450 nm 處檢測(cè)光吸收值。
在 SoftMax Pro 軟件中用 semi-log 擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度通過代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得出。
結(jié)果
通過麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 ( 圖 2 ) ，軟件自動(dòng)計(jì)算出麥醇溶蛋白濃 度 。 Z終濃度(ng/mL) 用計(jì)算出的濃度乘以原始啤酒樣品的稀釋因子 (500) 得出，麥醇溶蛋白(ng/mL) 除以 1000 轉(zhuǎn)變成麥醇溶蛋白(ppm)。為了將麥醇溶蛋白轉(zhuǎn)變成谷蛋白，使用因子 2 ( 國際食品藥典定義 ) ，Z終結(jié)果用谷蛋白 ppm 表示 ( 圖 3 ) 。這些計(jì)算都已添加在 S o f t M a x P r o 軟 件‘Unknow’樣品組的圖表中。
標(biāo)有低谷蛋白和無谷蛋白的啤酒檢測(cè)出的谷蛋白含量均低于 20 ppm，符合 FDA 指南要求。一個(gè)無谷蛋白啤酒樣品的重復(fù)，檢測(cè)出的 OD 值低于麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的Z低值，這個(gè)重復(fù)標(biāo)記為超出檢測(cè)范圍，在分組圖表中表示為‘R’( 圖 3 )。谷蛋白含量高的小麥啤酒，實(shí)際結(jié)果顯示麥醇溶蛋白檢測(cè)值超過標(biāo)準(zhǔn)品上限 270 ng/ mL， 在分組圖中也顯示超出檢測(cè)范圍。為了得到更準(zhǔn)確的定量谷蛋白，應(yīng)該繼續(xù)稀釋這款啤酒。其他啤酒檢測(cè)范圍在 14-118 ppm 谷蛋白，印度麥酒的谷蛋白含量低于 20 ppm‘無谷蛋白’水平。

金色麥芽酒 87 ppm 谷蛋白，按照國際食品法典標(biāo)準(zhǔn)可以貼上‘谷蛋白含量極低’的標(biāo)簽。在 SpectraMa x 多功能微孔板讀板機(jī)上獲得了同樣的檢測(cè)結(jié)果 (結(jié)果未顯示) 。
結(jié)論
RIDASCREEN 麥醇溶蛋白競(jìng)爭(zhēng) ELISA 試劑盒能夠定量啤酒中的谷蛋白含量。使用MultiWash+ 洗板機(jī)自動(dòng)洗板可以大大減少手動(dòng)操作時(shí)間。采用 SpectraMax ABSPlus 微孔板讀板機(jī)檢測(cè)光吸收值，采用SoftMax Pro 軟件中的方法計(jì)算檢測(cè)結(jié)果，以后還可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化 ELISA 工作流程并標(biāo)記所有結(jié)果。從樣品到結(jié)果，檢測(cè)得到可靠的谷蛋白含量?jī)H需 1 小時(shí)。