原理

試料中殘留的氯霉素，采用間位氯霉素或氘代氯霉素作內(nèi)標，依次用乙腈、4%氯化鈉去蛋白，正己烷脫脂，乙酸乙酯提取，固相萃取柱凈化，氮氣吹干，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，內(nèi)標法定量。

8.1 提取 取試料5 g（準確至±0.02 g），加內(nèi)標工作液250 μL、乙腈5 mL、 4 %氯化鈉溶液5 mL，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，殘渣重復提取1 次，合并上清液。加正己烷5 mL，渦旋振蕩1 min，2 000 r/min離心10 min，棄去上層液，正己烷重復處理1次。加水飽和的乙酸乙酯溶液5 mL，渦旋振蕩1 min，2 000 r/min離心10 min，上層液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，重復提取1次，合并提取液，氮氣吹干，加水-乙腈（95:5）3 mL使溶解，備用。

關(guān)鍵詞：動物組織中蛋白質(zhì)、脂肪、雜質(zhì)的去除

要點：

• GB 31658.2是采用4%的氯化鈉溶液對樣品中的蛋白質(zhì)進行沉淀，同時也加入了乙腈進一步沉淀樣品組織中的蛋白質(zhì)。然后，用正己烷進行萃取，去除動物組織中脂肪和雜質(zhì)。接下來乙酸乙酯反萃取。

關(guān)鍵詞：氮氣吹干

要點：

• 提取后，注意氮氣要吹干，如果沒有吹干，樣品中含有乙酸乙酯對后面的進行小柱凈化有影響，從而影響回收率。

關(guān)鍵詞：加水飽和乙酸乙酯溶液反萃取

要點：

• 由于洗脫液是用甲醇和水（1：1）4 mL，體積比較大，含水也比較高，不易揮發(fā)和濃縮。

• 加水飽和乙酸乙酯溶液進行反萃，實際上是進行了一個溶劑轉(zhuǎn)換。

• 轉(zhuǎn)換的目的，一方面是乙酸乙酯溶液比較容易吹干，另一方面也增加了一次萃取和凈化，使得樣品更加干凈，進一步去除雜質(zhì)。

8.2 凈化 取固相萃取柱，依次用甲醇、水各10 mL預洗。備用液過柱，加水洗柱2次，每次3 mL， 加流動相4 mL，以1 mL/min速度洗脫，收集洗脫液。加水飽和乙酸乙酯溶液4 mL，渦旋振 蕩1 min，2000 r/min離心5分鐘，取上層液，重復處理1次，合并上層溶液，氮氣吹干。加流動相1.0 mL使溶解，濾過，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

關(guān)鍵詞：預洗

要點：

• 在凈化過程中，C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL預洗，標準中凈化柱使用的是傳統(tǒng)的C18小柱 200 mg/6 mL (PN：AN60B004，納鷗科技），是一個很早就商品化的小柱，凈化之前，C18小柱需要提前預洗，不能直接對干的小柱進行活化，不然會影響到回收率。

• 這個與后續(xù)商品化的HLB-P小柱不同，HLB-P小柱省去傳統(tǒng)的活化、平衡步驟，樣品經(jīng)提取后直接過柱。

關(guān)鍵詞：多步驟的萃取和反萃取

要點：

• 氯霉素提取和凈化過程中經(jīng)過了多步驟的萃取和反萃取。

• 具體步驟：乙腈+4 %氯化鈉溶液提取→正己烷脫脂→加水飽和乙酸乙酯反萃→水-乙腈（95:5）復溶解→流動相洗脫→水飽和乙酸乙酯→流動相溶解→上機。

• 在GB 31658.2這是一個很經(jīng)典的提取體系，這么多次的萃取，實際上是利用了氯霉素在不同的溶劑體系中溶解度差異，從而來完成樣液的凈化和溶劑轉(zhuǎn)換。整個過程包括了，萃取、反萃取、固相萃取柱凈化，是一個很典型的樣品凈化和富集案例。

• 經(jīng)過以上復雜的前處理操作流程，操作手法不太熟練，以及某些關(guān)鍵點沒有注意到，很容易導致回收率受到影響。